Memoire : Stage En Neurologie A NYC

Camille DAVY Promotion 162 Janvier 2013

Le rôle de RCAN, un régulateur de la protéine Calcineurine, dans la phosphorylation de la protéine CREB et la localisation cellulaire de Calcineurine



Sommaire

Introduction................................................................................................2

I. Généralités.....................................................................................2

1. RCANestunrégulateurdel’activitédeCalcineurine......................2

2. RCANcontrôlel’activitédeCREBvialaCalcineurine.....................3

II. Protocole et méthodes misent en œuvres pour le fractionnement cellulaire...4 1. Isolementdel’hippocampeetincubation.....................................4 2. Isolementdesdifférentscompartimentscellulaires........................6

3. Numérationdesprotéinesetmigrationsurungel..........................7 4. Westernblot..........................................................................9 5. Anticorpsprimairesetsecondaires...........................................10 6. Détection.............................................................................11 7. Strippingetdeuxièmetest......................................................11

III. Résultats ......................................................................................12

IV. Discussion....................................................................................15

Conclusion.................................................................................... ..........17 Bibliographie.............................................................................................18 Annexe....................................................................................................19

Note: Cette étude ainsi que les figures ne sont pas encore publiées et sont dans tous les cas la propriété du laboratoire Charles Hoeffer et de la New York University

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La protéine RCAN, régulateur de l’activité de la protéine Calcineurine (CaN), est étudiée notamment pour son rôle dans la maladie d’Alzheimer. En effet, des analyses post mortem ont montré que RCAN était surexprimée chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer ou du syndrome de Down1. Ceci peut s’expliquer notamment par le fait que la surexpression de RCAN pourrait causer des enchevêtrements neurofibrillaires qui sont des dépôts dans les cellules nerveuses ou neurones d'une protéine appelée « protéine tau » qui a subi une phosphorylation, ceci a été montré chez des fétus présentant le syndrome de Down. On retrouve ces enchevêtrements neurofibrillaires comme caractéristiques observables chez les patients atteints de la maladie d’Alzheimer2 . On s’intéresse à l’action de RCAN sur Calcineurine et à ses conséquences sur l’activité phosphatase de Calcineurine sur la protéine CREB ainsi que sur la localisation cellulaire de Calcineurine au sein des cellules de l’hippocampe de souris.

I. Généralités

1. RCAN est un régulateur de l’activité de Calcineurine

RCAN est un gène situé sur le chromosome 21 3 qui est également celui du gène du syndrome de Down, la protéine RCAN, quant à elle, est active dans l’hippocampe, les organes gastro-intestinales et le cœur.

L’hippocampe est une structure paire du cerveau des mammifères qui se situe au niveau du lobe temporal médian, sous le

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Localisation de l’hippocampe chez l’homme (source : CESH)

cortex, elle est impliquée dans les phénomènes de localisation, de mémoire et d’apprentissage. L’hippocampe est le seul lieu de la neurogenèse à l’âge adulte et c’est également une des première structure atteinte par la maladie d’Alzheimer ce qui provoque des problèmes de mémoire et une désorientation.

Calcineurine est une enzyme qui déphosphoryle l’acide phosphorique en hydrolysant un mono ester (elle enlève un

groupement phosphate). Elle comprend 2 sous-unités : la sous unité A qui comporte le site catalytique du côté N-terminal, et la sous unité B qui possède un site régulateur, du côté C-terminal, dont le rôle auto inhibiteur est levé par liaison de la calmoduline associée au calcium. RCAN semble se fixer sur Calcineurine au milieu des deux chaines, il n’intervient donc pas sur son site catalytique mais pourrait stabiliser sa structure selon certains contextes cellulaires.

La concentration intracellulaire en calcium influence donc l’activité de CaN par l’activation de ses sous unités via la calmoduline. Le niveau de calcium optimal pour l’activité de CaN est bas d’après Stemmer and Klee in 1994. 4

Calcineurine est très répandue dans les tissus des mammifères, on trouve le niveau le plus important de Calcineurine au niveau de l’encéphale avec une prédominance dans le cytoplasme des cellules. 5

2. RCAN contrôle l’activité de CREB via la Calcineurine

CREB est une protéine ubiquitaire agissant comme un facteur de transcription liant

l'AMPc, c'est donc une protéine essentielle de la régulation de l'expression génétique. Elle est également impliquée dans les phénomènes de transmissions nerveuses.

En effet, CREB contrôle la formation des récepteurs AMPA qui sont fabriqués dans les ribosomes puis acheminés vers la surface des cellules neuronales au niveau des synapses, plus il y a de récepteurs AMPA, plus la transmission synaptiques sera rapide et efficace.

CREB possède donc de nombreux rôles essentiels au sein des cellules mais pour être active elle doit être phosphorylée.

Or, on sait que l’association de Calcineurine et RCAN favorise l’activité phosphatase de Calcineurine sur CREB.6 RCAN va donc diminuer l’activité de CREB en induisant sa déphosphorylation via la Calcineurine. Cependant CREB étant un facteur de transcription, il se situe dans le noyau des cellules, là où Calcineurine n’est, a priori, pas ou peu présente, on cherche donc a savoir si Calcineurine est presente dans le noyau des cellules et enfin si l’association entre RCAN et Calcineurine pourrait influencer la localisation de cette dernière en provoquant un

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