TP extraction de lipides de jaunes d'oeuf

COMPTE RENDU DU TRAVAUX PRATIQUES DE BIOMOLECULE A : BIOCHIMIE

1. But

Le but de ce TP est de déterminer la composition lipidique d’un jaune d’œuf. Pour cela, on réalise une extraction des lipides du jaune d’œuf pour, par la suite les déterminer à l’aide de deux chromatographies sur couche mince en comparant leurs migrations à celles de lipides témoins.

1. Principe

Dans un premier temps, nous effectuons l’extraction des lipides contenus dans le jaune d’œuf qui est lyophilisé. Nous mettons 50mg de jaune d’œuf lyophilisé dans un tube à essai puis on ajoute 1mL du mélange chloroforme/méthanol (2 :1)préalablement introduit dans un second tube à essai, 2mL de chloroforme et 1mL de méthanol mélangé au VORTEX. On sait que les lipides sont miscibles avec la phase organique donc on obtient :

• Une première couche dite de surnageant qui est constituée de lipides et de solvant organique.
• Une deuxième couche dite de dépôt qui est constituée des autres composants de ce jaune d’œuf lyophilisé.

Dans un second temps, nous effectuons deux chromatographies. Cette technique sépare les constituants d’un mélange, ce qui s’explique grâce à leur différence d’affinité avec les deux phases :

• Une phase stationnaire à l’état solide, qui est absorbante. De plus, elle est composée de silice. Cette phase est polaire.
• Une phase mobile qui est constituée par un solvant ou un mélange de solvant : c’est la phase apolaire.

Pour la première chromatographie sur couche mince, la phase mobile contient 20 mL de solvant hexane/éther diéthylique/acide acétique (70 :30 :1). Afin d’introduire les solvants dans de bonnes mesures nous devons calculer le rapport 20/101(total des trois solvants) ~ 0.200, puis faire le produit de ce résultat avec les proportions indiquées dans l’énoncé soit :

• Hexane : 70 x 0.200 = 14mL
• Ether Diéthylique : 30 x 0.200 = 6mL
• Acide Acétique : 1 x 0.200 = 0.200 mL

• Dans la cuve pour la chromatographie

Pour la seconde chromatographie sur couche mince, la phase mobile contient également 20 mL de solvant dichlorométhane/méthanol/eau (65 :25 :3), 20/93 ~ 0.200 soit :

• Dichlorométhane : 65 x 0.200 = 13 mL
• Méthanol : 35 x 0.200 = 5mL
• Eau : 3 x 0.200 = 0.6 mL

• Dans la cuve pour la chromatographie

Les produits déposés sur la ligne de dépots de la phase stationnaire à l’aide de capillaires diffèrent de la CCM 1 à la CCM2.

Produits de la CCM1 :

• Acide Gras
• Monoacylglycérol
• 1,3-Diacylglycérol
• 1,2 Diacylglycérol
• Triacylglycérol
• Extrait du jaune d’œuf (premier temps de l’expérience)
• Cholestérol
• 1,3-Diacylglycérol + 1,2 Diacylglycérol
• 1,3-Diacylglycérol + 1,2 Diacylglycérol + Cholestérol
• Ester de Cholestérol
• Phosphatidylcholine
• Phosphatidyléthanolamine

Produits de la CCM2 :

• Monoacylglycérol
• Cholestérol
• Extrait de jaune d’œuf (premier temps de l’expérience)
• Phosphatidylcholine
• Phosphatidyléthanolamine

• Cependant afin de révéler la conclusion des deux chromatographies sur couche mince, nous avons dû les introduire dans un bac de coloration par le bleu de Coomassie puis 5-6 minutes plus tard nous les plongeons dans un bac de décoloration. Suite à la décoloration nous séchons la plaque.
• Suite à la révélation, nous avons pu observer le résultat de nos deux CCM.

Le principe de la chromatographie est le suivant, la phase mobile (solvant ou mélange de solvant) migre vers le long de la phase stationnaire (plaque de silice). Cette phase mobile, lors de sa migration, entraine avec les produits qui ont été préalablement déposés sur la ligne de dépôt au niveau de la phase stationnaire. La vitesse de migration de chaque produit lui est propre c'est-à-dire que chaque produit ne migre pas en même temps, également, la hauteur de la migration sur la phase stationnaire dépend du produit.

L’explication à cela est le fait que ces deux phénomènes dépendant de l’affinité du produit avec les deux phases. La distance parcourue par le solvant lors de sa migration est définie par le rapport frontal (Rf) caractérisé par la relation :

[pic 1]

[pic 2]

• Chaque tâche sur la CCM désigne un constituant que l’on identifie grâce à son rapport frontal que l’on compare avec celui d’un témoin.

1. Résultats et interprétation

• CALCUL DES REFERENCES FRONTALES (aidé de la correction de la professeure pour certains dépôts)

...