Méthode d'analyse des composés biologiques

Analyse des protéines par spectrométrie de masse

La spectrophotométrie de masse sert à :

• Détecter la présence de substances dopantes chez les athlètes
• Étudier la composition de molécules trouvées dans l’espace
• Rechercher la présence de toxine, pesticides, polluants dans l’alimentation
• Détecter des mutations génétiques
• Identifier des marqueurs de pathologies etc.
• Dater des objets archéologiques
• Vérifier l’authenticité des œuvres d’art
• Déterminer la séquence d’une protéine d’intérêt : identifier des variations de séquences, la fonction et l’expression

1.  Présentation générale

La spectrométrie de masse est une « balance moléculaire ».

Cette méthode permet de « peser » des molécules avec une très grande précision 🡪 détermination de leur masse moléculaire. Cette mesure de masse de molécules individuelles et ionisées se fait par rapport à leur nombre de charges : m/z. m= masse moléculaire et z= nombre de charges

1. Mesure du m/z d’un composé 🡪 masse moléculaire de la molécule
2. Mesure de la masse des fragments de ce composé -> Information de structure
3. Mesure de leur quantité

[pic 1]

[pic 2]

Fluctuation dues aux isotopes d’azote, hydrogène etc…

L’unité de mesure de masse :

La masse M s’exprime en Dalton (Da) ou l’unité de masse atomique unifiée (u). 

🡪 1 Da = (1/12 de la masse d’un atome de 12C) / NA                

Avec : NA = 6,022.1023 mol-1

1 mole : 6.1023 molécules

1 DA = 1,66.10-27 kg

La résolution permet de distinguer des masses différentes : R = M/ΔM. La précision est de 1Da 🡪 10 Da.

Combien de molécules peut-on détecter et mesurer ?

• Sensibilité

[pic 3][pic 4][pic 5]

• Résolution

Capacité de pouvoir distinguer 2 masses proches

La résolution permet de distinguer des masses différentes : R = M/ΔM.         

• HR = haute résolution : R de l’odre de >10^4 : différence réduite entre les 2 masses
• BR = Basse résolution : R de l’ordre de <10^4

La précision est de 1Da 🡪 10 Da.

Principe général de la spectrométrie de masse

Isoler la molécule :

• Phase gazeuse 
• Ioniser la molécule

🡪 Exploitation des propriétés reliant : énergie/trajectoire/masse.

🡪 Utilisation de champs électromagnétiques

1. Instrumentation et principe de mesure 

Spéctrométrie de masse : 3 cubes du milieu

        Source : élement qui produit la molécule analysable

        Analyseur(s) : séparation les ions en fonction de leur rapport m/z

        Détecteur : compter le nombre d’ions

Entrée : préparation de l’échantillon

Traitement de l’info : lecture du spectre de masse [pic 6]

1. Les sources d’ionisations

Rôle : isoler la molécule (phase gazeuse ; ioniser la molécule)

• Volatiliser : le source doit permettre le passage à l’état de matière condensée à un état gazeux
• Ioniser : transformer les molécules en ions, produire des espèces chargées car un spectromètre de masse (analyseur) fonctionne grâce à des champs électriques.

Ex : protéine : changer le pH (acide)🡪 Charge +

Deux grands types d’ionisation pour l’étude des protéines/peptides :

• MALDI : Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation
• ESI : ElectroSpray[pic 7]

Le MALDI :  on a une plaque sur laquelle on dépose une matrice (gluante) dans laquelle les protéines sont suspendu. Cette substance permet la libération de protons dans un champ électrique sous l’impact d’un laser = volatilisation. Le champ électrique permet la résorption de la matrice qui cède ainsi ses protons prêts à rentrer dans l’analyseur.

• Transfert d’un proton de la matrice vers l’échantillon (monochargé= 1 seul proton) :         XH+ + M 🡪 MH+ + X. 
• Ionisation douce : pas de fragment. Le laser ne va pas casser des liaisons covalentes

L’ESI : Cône de Taylor : le champ électrique déforme la solution permettant de pulvériser la solution, former un spray et ensuite forme un cône de nébulisation. Fission des microgouttelettes entraîne une désolvatation de notre solution permettant la génération d’ion rentrant dans l’analyseur. [pic 8]

• Transfert de proton(s) du solvant vers l’échantillon (monochargés et multichargés) :

H+ + M 🡪 MH+ ou xH+ + M 🡪 MH+x.

• Ionisation douce : pas de fragments. 

1. Les analyseurs

= Séparation des ions produits en fonction de leur rapport m/z grâce à des champs électromagnétiques   Opèrent en condition de vide poussé pour éviter la collision des ions avec des molécules de l’air.  

...