Electrophorese : immunoglobulineg

TP ELECTROPHORESE

BUT :

Dans ce Tp nous allons analyser et évaluer la qualité et la pureté de l’enzyme purifié lors de l’expérience précédente. Nous allons également étudier la structure de l’Immunoglobuline G de souris (IgG), à travers des techniques analytiques tels que le Western-Blot et la SDS-PAGE.

L’IgG est composé quatre chaines, deux lourdes et deux légères lies entre elles par des ponts disulfures.[pic 1]

Chaque chaine a un poids moléculaire bien diffèrent notamment 50kDa pour chaque chaine lourde et de 25kDa pour chaque chaine légère. Le poids moléculaire totale est de 150kDa quand la molécule est sous sa forme complète.  

PRINCIPES :

SDS-PAGE : L’électrophorèse SDS-PAGE, repose comme toute technique électrophorétique, sur la séparation de molécules chargées dans un champ électrique en fonction de leur poids moléculaire. Une cuve à électrophorèse est reliée à deux bornes (une cathode (-) et une anode (+)) alimentées par un générateur électrique : les molécules que l’on intercale dans ce champ migreront, selon leur charge, vers le pôle complémentaire.

La particularité de la SDS-PAGE est de soumettre les échantillons protéiques à un prétraitement dénaturant. Les protéines sont soumises à l’action de deux composés :

• le β mercaptoéthanol est un composé qui exerce une action dénaturante sur les protéines oligomériques en rompant les ponts disulfures, ce qui désorganise leur structure tridimensionnelle. Les sous unités des protéines sont donc dissociées.
• le SDS (sodium dodécyl sulfate) : c’est un composé capable de venir se fixer sur la périphérie des chaines de protéines tout en leur conférant une charge négative.

Grâce à la SDS-PAGE il est possible de déterminer assez finement la présence d’une protéine donnée dans un échantillon protéique. La coloration se fait généralement par du Bleu de Coomassie.

WESTERN BLOT : C’est une technique de transfert protéique à partir du gel issu du SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose. L’intérêt du western blot est de vérifier avec précision la présence ou non d’une protéine exacte dans un échantillon donnée grâce à une immunorevelation mettant en jeux un anticorps spécifique à la protéine d’intérêt.

ANALYSE ET RESULTATS :

• PREPARATION DES ECHANTILLION :

La solution 1 contient un mélange de Tris-HCl, SDS, Glycérol et bleu de bromophénol  qui va nous servir pour dénaturaliser nos protéines. Une deuxième solution appelé solution 2 est utilisé, contenant en plus du β-mercaptoéthanol, va permettre la rupture des ponts disulfures chose que le SDS seul ne peut faire.

• PREPARATION DES GELS DE POLYACRYLAMIDE ET SEPARATION DES PROTEINES :

Pour cette expérience nous avons préparé deux gels de séparation à deux concentrations différentes à fin d’étudier  l’impact que la concentration du gel peut avoir sur la migration de protéines.

Nous avons préparé un gel à C=15% et le deuxième à C=10% :

                                                                              Le gel de séparation est le support ou les protéinés vont se séparer, le gel après polymérisation grâce à la catalyse du TEMED et du Persulfate d’ammonium va avoir un effet de tamis moléculaire permettant de séparer les protéinés selon leur poids moléculaire.  A gauche nous pouvons voir un « pore » formé lors de la polymérisation du gel.[pic 2]

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