EXTRACTION DU LYSOZYME DE BLANC D’ŒUF

Compte rendu du TP :

EXTRACTION DU LYSOZYME DE BLANC D’ŒUF

1/ BUT du TP

Le TP a pour but de purifier une protéine contenue dans le blanc d’œuf de poule à l’aide d’une résine échangeuse d’ions : le lysozyme. Nous devons également caractériser ce lysozyme après notre purification afin d’en déterminer les principaux aspects comme son activité spécifique et son rendement. Nous pourrons alors conclure sur l’aspect quantitatif et qualitatif de notre purification.

2/ PRINCIPE

Dans ce TP nous avons eu recours à 3 méthodes différentes :

· La chromatographie échangeuse d’ions

· La spectrophotométrie

· Le dosage des protéines à l’aide du réactif de Bradford

1ère méthode : La chromatographie échangeuse d’ions

Cette méthode permet donc la séparation de molécules et fonctionne sur le principe suivant :

1- Type de chromatographie : ionique

2-Phase stationnaire : résine échangeuse d’ions, dans ce TP nous avons utilisé une résine échangeuse de cations : la carboxyméthyl-cellulose (CM-cellulose). Elle comporte des groupements ionisés négatifs auxquels des ions mobiles positifs se lient grâce à des interactions faibles afin d’assurer l’électroneutralité.

Phase mobile : une solution saline

3-Critère de séparation : la charge des protéine

4-Grandeur caractéristique : temps ou volume d’élution (par absorbance)

5-Critère d’identification : mélange de molécules dont la concentration est connue (gamme étalon)

Cette méthode de séparation se base donc sur la différence de charges des molécules et sur la capacité d’adsorption réversible de la résine.

Dans le cadre de ce TP, nous avons une résine échangeuse de cations cela signifie que la résine est chargée négativement et donc pour que les protéines puissent se fixer sur celle-ci elles devront être chargées positivement. Pour cela on s’intéresse donc à la charge des différentes protéines du blanc d’œuf au pH d’équilibration de chacun de ces acides aminés afin de pouvoir calculer le pH isoélectrique (pHi) qui permet de déterminer la charge de l’acide aminé à n’importe quel pH, c’est-à-dire :

· A un pH> pHi la protéine est chargée négativement

· A un pH< pHi la protéine est chargée positivement

En effet le pHi correspond à la charge nulle d’une protéine.

2ème méthode : La spectrophotométrie

Pour réaliser une spectrophotométrie, nous devrons sélectionner une longueur d’onde qui va dépendre du composé étudié. Ici, la coloration nous sera donnée par le réactif de Bradford qui absorbe à 595 nm. Avant de commencer toute mesure, il est nécessaire de faire le zéro optique. En effet, nous devons régler le spectrophotomètre à l’aide d’eau distillée afin de lire une absorbance de 0 sur celle-ci. L’absorbance sera ensuite mesurée selon la formule : A = log Io/I avec Io l’intensité lumineuse et I l’intensité transmise. On pourra ainsi appliquer la loi de Beer-Lambert : A = ε x l x C. Avec ε le coefficient d’adsorption spécifique en cm.mol-1.L ; l l’épaisseur de la cuve en cm et C la concentration en mol/L.

Le principe de la spectrophotométrie sera également utilisée dans ce TP afin de déterminer la vitesse initiale enzymatique du lysozyme en présence de son substrat. En effet nous nous servirons de la diminution de la turbidité de la solution de substrat en présence du lysozyme. En effet le lysozyme hydrolyse les liaisons β-1→4 entre l’acide N-acétylmuraminique et 2-acétoamido-2-désoxy-D-glucose, composant essentiel des parois bactérienne. Ainsi un substrat contenant une suspension de membranes de Micrococcus Lysodeikticus sera hydrolysé par le lysozyme faisant baisser la turbidité de la solution et donc augmenter la densité optique. On pourra donc obtenir à l’aide d’un ordinateur, la densité optique en fonction du temps.

3ème méthode : Le dosage des protéines à l’aide du réactif de Bradford

Le réactif de Bradford est composé de Bleu de Coomassie appelé Brillant Blue Coomassie G-250. Il est de couleur marron et devient bleu en présence de protéines. Son maximum d’absorbance se situe vers 595 nm, qui nous permettra d’effectuer une spectrophotométrie. Il interagit avec les protéines par interactions hydrophobes avec les acides aminés hydrophobes et électrostatiques avec les acides aminés basiques. L’absorbance mesurée sera proportionnelle à la quantité de protéines dosées. On réalisera donc une gamme étalon avec une solution de protéines de concentration connue.

3/ RESULTATS ET INTERPRETATIONS

Préparation des tampons :

-Tampon d’équilibration

A partir des solutions stocks de NaCl à 0.5M et Tris-HCl à 0.5M pH 8.2, on cherche à préparer une solution de 250 mL de concentration en NaCl et Tris-HCl de 0.05M. On cherche donc le volume de solution mère (Vm) à prélever.

Ainsi pour NaCl : Cm x Vm = Cf x Vf

Vm = (Cf x Vf) / Cm

Vm = (0.05 x 250) / 0.5

Vm = 25 mL

De même pour le volume mère de Tris-HCl à prélever on a :

Cm x Vm = Cf x Vf

Vm = (Cf x Vf) / Cm

Vm = (0.05 x 250) / 0.5

Vm = 25 mL

On doit donc diluer dans 200 mL d’eau.

-Tampon d’élution

On cherche à préparer 40mL de solution tampon carbonate à 0.2M et de pH 10.5 à partir de deux solutions à 0.2 M. On a l’acide A : Bicarbonate de sodium et la base B : Carbonate de sodium.

On a : pH = PKa + log [B]/[A]

10.5 = 10.3 + log [B]/[A]

log [B]/[A] = 0.2

[B]/[A]

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