Compte rendu de travaux pratiques (TP) de bactériologie

Compte rendu de travaux pratiques (TP) de bactériologie [pic 1]

        La bactériologie est une discipline de la biologie, consistant en l’étude des bactéries. Elle sert notamment  à les identifier et les caractériser (familles et souches). Nous verrons à travers ce TP les différentes étapes, allant de la préparation du milieu d’ensemencement à la coloration différentielle de GRAM, et conduisant à la différenciation des bactéries et à leur identification, les bactéries provenant ici de divers environnements détaillés plus bas. La méthode de coloration de GRAM repose sur une différence fondamentale entre la composition chimique des parois des bactéries, et on distingue les bactéries à Gram+ et celles à Gram -.

1. Matériel et méthodes

1. Préparation du milieu d’ensemencement

Matériel :

• Béchers de 500 ml
• Thermomètre
• Agitateur  
• Bec bunsen
• Trépied et sa grille
• Boîtes de Pétri
• Pinces en bois ou gants
• Gélose nutritive (GN)
• Eau distillée

Méthodes :

• On pèse la masse nécessaire de poudre GN pour 250 ml d’eau distillée qu’on dissout dans le diluant à l’aide de l’agitateur.
• On chauffe le mélange obtenu au bec bunsen jusqu’à ébullition et on laisse refroidir la préparation. Lorsqu’elle atteint une température inférieure à 60°, on la coule dans les boîtes de Pétri stériles.

1. Mise en évidence de la présence de micro-organismes au laboratoire

Matériel :

• Milieux gélosés en boîte de pétri
• Ecouvillon
• Pièce de monnaie
• Cheveu
• De la terre récupérée à partir d’un pot de fleur ou de plante

Méthodes : 

On prend 3 milieux gélosés en boîte de pétri. (figure 1)

• Dans la boîte 1 : deux secteurs, sur le premier secteur, un cheveu et sur le second, un ensemencement de deux gouttes de terre mélangées à de l’eau distillée,
• dans la boîte 2 : quatre secteurs, sur le premier secteur, une trace de doigt ; sur le second, une trace de doigt après lavage de main ; sur le troisième, une pièce de monnaie ; et sur le quatrième, un écouvillon frotté contre la paillasse et appliqué sur le secteur,  
• la boîte 3 est laissée ouverte au dessus de la paillasse environ 10 minutes.

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• A la fin de la manipulation, on regroupe les différentes boîtes de pétri et on les place à l’étuve en position retournée à 37°C pendant 24 heures.

1. Examen macroscopique des cultures

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Après les 24 heures d’incubation, on obtient des colonies bactériennes contenues dans les boîtes de pétri. On note les caractéristiques suivantes :

• leur taille
• leur forme
• l’aspect de leur surface
• leur consistance
• leur couleur et/ou leur pigment

1. Examen microscopique des bactéries

Cet examen a pour but d’étudier la morphologie d’une cellule bactérienne. Il ne contient qu’une seule étape à savoir l’examen à l’état frais.

L’examen à l’état frais correspond à l’examen microscopique des bactéries vivantes en milieu liquide, permettant d’apprécier leur mobilité et leur morphologie. Il est fait à partir d’une culture sur milieu solide.

Matériel :

• Lame et lamelle
• Anse de platine
• Microscope

Méthodes :

        On dépose une gouttelette de liquide sur la lame puis on prélève une trace de culture à l’aide d’une anse de platine qu’on émulsionne dans le liquide, puis on recouvre la lame d’une lamelle.

1. Examen après coloration

Matériel :

• Lame de verre
• Anse de platine
• Pince
• Bec bunsen

Méthodes :

Réalisation du frottis (figure 2)

1. Etalement sur lame de verre

• On note la référence de l’échantillon sur une lame parfaitement propre et dégraissée.
• On prélève de façon stérile, à l’aide d’une anse de platine, une goutte de culture bactérienne qu’on étale en film mince.

1. Séchage : il est effectué à l’air libre jusqu’à ce que le frottis présente un aspect mat.
2. Fixation du frottis sec : consiste à tuer les bactéries et à les coller sur la lame sans altérer leur structure.

• On passe la lame 3 à 4 fois dans la flamme du bec bunsen, la lame étant tenue par une pince.
• On laisse refroidir la lame avant de commencer la coloration de Gram.

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1. Coloration différentielle de Gram

Matériel :

Réactifs :

• Violet de gentiane phénique
• Lugol (iodo-iodure de potassium)
• Alcool à 95%
• Fuschine phéniquée de ziehl

Méthodes :

• On réalise un frottis qu’on fixe à la flamme.
• On y verse le violet de Gentiane qu’on laisse en contact avec le frottis une minute.
• On jette le colorant, on chasse ce dernier par la solution de Lugol qu’on laisse agir une minute.
• On jette le lugol et on fait couler de l’alcool à 95% sur la préparation qu’on laisse agir une minute ensuite on lave abondamment.
• Enfin, on sèche la lame au dessus d’un bec bunsen.

Les étapes ci-dessus sont schématisées sur la figure 3.

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1. Résultats

1. Examen macroscopique des cultures

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