Compte rendu d'enzymologie

Sommaire

I.        Introduction        1

II.        Matériel et méthodes        2

III.        Protocole        3

A.        Formation de la Chymotrypsine        3

B.        Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme        5

C.        Étude spectrale de l’interaction Chymotrypsine/ Proflavine        7

IV.        Résultats        8

A.        Formation de la Chymotrypsine        8

B.        Détermination des paramètres cinétiques de l’enzyme        9

C.        Étude spectrale de l’interaction Chymotrypsine/ Proflavine        12

V.        Discussion        12

VI.        Conclusion        13

1. Introduction

La chymotrypsine est une enzyme protéolytique, faisant partie des protéases à sérine, elle est sécrétée dans l’intestin grêle par le pancréas sous forme d’un précurseur inactif appelé chymotrypsinogène, elle est ensuite exportée vers la lumière intestinale où ce précurseur inactif ou zymogène va être activé par l’action de la trypsine, qui est une autre enzyme protéolytique.

Le site actif d’une enzyme est composé de deux régions principales, le site de fixation et le site de la catalyse. Le site de la catalyse de la chymotrypsine contient trois acides aminés : l’Histidine 57, l’Asparagine 102, et la Sérine 195. Ces trois résidus constituent la triade catalytique. Le rôle de la chymotrypsine est donc de catalyser l’hydrolyse des protéines dans l’intestin grêle. En effet, la chymotrypsine clive les liaisons peptidiques dont le carbonyle appartient soit à L-acide aminé aromatique, comme la tyrosine, le tryptophane et la phénylalanine, soit à L-acide aminé non aromatique hydrophobe, comme la leucine et l’alanine, avec pour condition une chaine latérale ne soit pas trop volumineuse.

Au cours de ce TP, dans un premier temps nous avons activé le chymotrypsinogène par la trypsine, puis nous avons analysé le produit de la réaction par électrophorèse. Dans un second temps nous avons étudier l’activité de la chymotrypsine avec un substrat spécifique, plus précisément le Bz-Y-pNA, en présent et en absence d’inhibiteur, qui est l’aprotinine. Pour finir nous avons analyser les interactions du site actif de la chymotrypsine avec la proflavine par spectroscopie UV-Visible. La proflavine est une petite molécule qui agit comme un inhibiteur compétitif de la chymotrypsine.          [pic 1]

Chymotrypsinogène                  Chymotrypsine [pic 2]

1. Matériel et méthodes

Notre TP s’est déroulé en trois étapes. Lors de ces trois parties nous avons utilisé le matériel suivant :

• Pipettes man : P1000, P200, P20
• Pipette
• Un vortex
• Du Parafilm
• Cuves
• Spectrophotomètre
• Tubes d’Eppendorf
• De l’eau distillée

Nous avons utilisé les solutions suivantes :

• Trypsine à 2 mg/mL dans le tampon Tris-HCl 50 mM pH 8, NaCl 100 mM, CaCl2 50 mM = Activation
• Solution de Bz-Y-pNA à 2 mM dans le DMSO (diméthylsulfoxide) = substrat
• Solution HCl 10-2M, KCl 500 mM = Élution trypsine
• Solution de Aprotinine (M=6551.5 g/mol) à 0,1 mg/mL (dans H2O) : inhibiteur
• Tampon Tris-HCl 50 mM pH 8.0 KCl 500 mM, CaCl2 20 mM = Élution chymotrypsine
• Tampon Tris-HCl 50 mM pH 7.5 NaCl 100 mM = Activé
• De l’eau distillée
• Solution mère de proflavine à 0.2 mM (H2O)
• Solution mère de chymotrypsinogène à 10 mg/mL
• Notre Solution de Chymotrypsine activée
• Dioxane

Nous avons utilisé dans la première et deuxième partie du TP, la méthode de spectrophotométrie, il s’agit d’une méthode analytique quantitative qui consiste à mesurer l’absorbance ou la densité optique d’une solution.

Pour cela, nous avons utilisé un spectrophotomètre, dans un premier temps nous avons effectué le paramétrage du programme « cinétique » du spectrophotomètre, en absorbance à 410 nm en fonction du temps, pendant 2 minutes. La p-nitraniline absorbe à 410 nm ce qui permet une mesure spectrophotométrique du produit formé au cours de la réaction.

Nous avons procédé à une chromatographie d’affinité, ce processus repose sur le fait que la trypsine sera retenue sur le gel de sépharose car celle-ci contient le p-aminobenzamidine qui est un ligand spécifique de cette enzyme. Lors de l’élimination de la trypsine, nous avons mesuré l’absorbance à 280 nm.

Dans la deuxième partie du TP nous avons utilisé l’équation de Michaelis-Menten pour calculer les caractéristiques de l’enzyme en ne fixant qu’une molécule de substrat par molécule d’enzyme.

Dans la dernière partie du TP nous avons utilisé la méthode de spectroscopie UV-Visible, il s’agit d’un processus de spectroscopie mettant en jeu les photons dont les longueurs d’onde sont dans le domaine ultraviolet, soit entre 100 nm – 400 nm ; du visible, soit de 400 nm – 750 nm ; ou du proche infrarouge, soit de 750 nm – 1 400 nm. Elle est basée sur la propriété des molécules d’absorber des radiations lumineuses de longueur d’onde déterminée. Nous avons pour cela utilisé des cuves différentes, en effet les cuves en plastique ne sont pas adaptées, elles doivent être transparente aux radiations du domaine d’étude.

1. Protocole 

1. Formation de la Chymotrypsine

• Activation

Pour activer le chymotrypsinogène, on doit peser 20 mg de chymotrypsinogène dans 2 mL de solution de Tampon d’activation, puis on prélève 10 µl de cette solution dans chaque

Dans un premier temps, nous avons pesé 20 mg de chymotrypsinogène dans 2 mL de solution de Tampon d’activation pour activer le chymotrypsinogène nous avons ajouté la trypsine à 10 µl de solution de chymotrypsinogène, dans un rapport de trypsine / chymotrypsinogène de 1%.

Soit 1 mg de trypsine pour 100 mg de chymotrypsinogène, en faisant le produit en croix on trouve la quantité de trypsine : (2 mg x 10 mg) / 100 mg = 200 mg. La quantité de trypsine sera de 200 mg.

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