COMPTE RENDU ENZYMOLOGIE

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Purification et analyse cinétique de la trypsine

INTRODUCTION

Les enzymes digestives sont des protéines dont le rôle est de découper des molécules complexes en molécules simples afin d'en faciliter la digestion. Elles sont présentes tout le long du tube digestif : au niveau de la salive, de l'estomac et de l'intestin. Elles sont de différents types en fonction des classes de molécules qu'elles clivent. On trouve donc essentiellement des enzymes protéolytiques, glycolytiques et lipolytiques selon qu'elles agissent sur les protéines, les glucides ou les lipides.

La trypsine est une protéase synthétisée sous forme d’un précurseur inactif, le zymogène, qui est activé par coupure protéolytique par des protéases à sérine. C’est essentiellement une endo-peptidases produite par les acinis du pancréas, qui hydrolyse la liaison peptidique après (C-terminal) de Lys et Arg sauf si les acides aminés sont suivis par une proline. Elle agit de ce fait très bien sur un substrat cinétique qui sera ici la BaPNA (Benzoyl L Arginine- Para NitroAniline) selon les mécanismes suivants : le BaPNA se place sur le site actif de la trypsine et subit une hydrolyse de sa liaison amide (celle juste après don résidu arginine), ce qui libère un produit de couleur jaune qu’est la Para Nitro Aniline.

But

Nous souhaitons purifier de la trypsine bovine par chromatographie d’échangeur d’ions l’analyser par électrophorèse sur gel d’acrylamideSDS-PAGE pour ensuite mesurer l’activité enzymatique par spectrophotométrie et puis déterminer les paramètres cinétiques de cette enzyme avec la BANPA

Principe

Chromatographie

C’est une méthode de purification basée sur la séparation des molécules selon leur charge globale. La colonne est constituée d’une matrice sur laquelle sont greffés des groupements ionisables chargés négativement au pH de travail. Cette matrice sera donc capable de retenir des molécules chargées positivement (cations). Dans le cas des protéines elles seront chargées positivement si leur pHi est supérieur au pH de travail. Les protéines chargées positivement seront retenues sur la colonne alors que les protéines neutres ou chargées négativement ne seront pas retenues et seront éluées en premier. Pour éluer les molécules positives retenues sur la colonne, il faut appliquer un gradient de force ionique (NaCl par exemple) ou l’ion Na+ jouera le rôle d’un compétiteur qui va se fixer à la colonne pour libérer ainsi les molécules chargées positivement. On peut aussi utiliser un gradient de pH croissant.

Mode opératoire

1. Equilibrer la colonne : on dépose sur la colonne 5 fois de suite un volume de 1 ml du tampon Tris-HCl 50 mM pH 5,5 (la colonne ne doit pas sécher entre un dépôt et un autre).
2. Préparation de l’échantillon : on dilue la solution protéique en prenant 0.2 ml de l’échantillon et l’ajoutant à 1.8 ml de la solution tampon.
3. Charge de la colonne : on garde 0.1 ml de la solution obtenue (échantillon dilué) dans un eppendrof pour l’électrophorèse et la mesure d’activité enzymatique et on dépose le reste sur la colonne en utilisant une pipette pasteur. On collecte immédiatement la fraction élué (qu’on notera NR) dans un microtube de 2 ml.
4. Lavage de la colonne : on dépose 1 ml de la solution tampon pour récupérer les protéines qui ne sont pas retenues par la colonne (qu’on notera F1) dans un eppendrof.
5. Elution par gradient de force ionique : on doit déposer 1 ml des différents tampons Tris-HCl 50 mM pH 5.5 contenant : -NaCl 100 mM fraction 2

                                                               -NaCl 150 mM fraction 3

                                                               -NaCl 200 mM fraction 4

                                                               -NaCl 250 mM fraction 5

                                                               -NaCl 500 mM fraction 6

6)  Conserver les fractions dans la glace

Electrophorèse

L’électrophorèse est une méthode de séparation des molécules sous l’effet d’un champ électrique. Dans le cas des protéines, l’électrophorèse est réalisée sur un gel de polyacrylamide constitué d’un réseau de maille plus ou moins large dans lequel les plus grosses molécules sont freinées par rapport au plus petites. La séparation des protéines par électrophorèse sur gel de polyacrylamide dépend donc de la charge et de la taille des protéines. En conditions dénaturantes, on utilise du -mercaptoéthanol ou du dithiothreitol (DTT) qui permet la coupure des ponts disulfures et du sodium dodecyl sulfate (SDS) qui entoure les protéines de charges négatives. En condition dénaturantes, les protéines chargées négativement se déplaceront toutes vers l’anode et leur séparation sur le gel dépendra uniquement de leur taille.

Mode opératoire

Préparation des gels d’électrophorèse

Dans un premier temps on installe les plaques de verre sur le support et on vérifie l’étanchéité avec de l’eau, et on prépare les solutions

1. Gel de résolution on prépare le mélange suivant : 15mL de solution pour gel de séparation + 0.09 mL de catalyseur 1 + 0.005 mL de catalyseur 2

On verse directement le mélange entre les deux plaques avec une pipette pasteur avant que le gel se polymérise ensuite on ajoute un peu d’eau (le mélange ne se polymérise pas bien avec l’air). Quand le gel se polymérise on retire l’eau et on prépare le deuxième gel.

1. Gel de concentration on mélange : 7mL de solution pour gel de concentration+ 0.07 mL de catalyseur 1 + 0.007 mL de catalyseur 2

On verse rapidement le gel dans l’espace entre les deux plaques avec la pipette pasteur et on installe le peigne.

Après la polymérisation des gels on installe les plaques sur le support et on remplit avec le tampon de migration.

Préparation des échantillons

On ajoute 0.01 mL du tampon de dénaturation dans chaque tube des fractions collectées et on chauffe pendant 2 min à 90°c pour dénaturer les protéines.

Dépôt des échantillons

On dépose dans le premier puits 0.01 mL de la solution des protéines de référence et 0.02mL des échantillons dans chaque puits.

La migration s’effectue sous l’action d’un courant électrique de 80 mA pendant 45 min ensuite on récupère le tampon de migration et on démoule le gel et on le pose dans une boite en plastique

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