Clonage de molécules d'ADN du bactériophage λ dans le plasmide pBlueScript

Clonage de molécules d'ADN du bactériophage λ dans le plasmide pBlueScript

Résumé :

Lors de ce TP de biologie moléculaire nous avions pour objectif de découper un fragment d'ADN en plusieurs morceaux grâce aux enzymes de restrictions. Une fois le fragment découpé, soit l’insert, on l'introduit dans un plasmide coupé avec les mêmes enzymes de restrictions. Nous rappelons qu’un plasmide est molécule d’ADN distincte de l’ADN chromosomique qui est capable de se répliquer de manière autonome et qui n’est pas essentielle à la survie de la cellule. Afin de savoir si la ligation a bien fonctionné nous avons fait une analyse par électrophorèse. Une ligation permet de lier l'insert et le plasmide pour donner un plasmide recombinant. Une fois la ligation terminée, nous avons introduit le plasmide recombinant dans une bactérie pour que celle-ci le multiplie.

Abréviations :

ADN : Acide Désoxyribonucléique

X : fois (concentration)

pBS : plasmide BlueScript

TP : travaux pratique

PCR : Polymérase Chain Reaction

Introduction :

Le principe du clonage est de multiplier un fragment d'ADN, pour en avoir une ou plusieurs copies à l'identique. Bien qu’il y ait une forte ressemblance, nous pouvons retrouver dans ces copies des mondifications tel que des mutations pour un fragment d’ADN, cependant la probabilité de retrouver ce genre de modification reste faible.                                      Un plasmide est une molécule d'ADN circulaire présent exclusivement chez les cellules procaryotes comme les bactéries.

Le clonage est une méthode d'amplification qui est rentable mais il existe aussi la PCR, qui est une technique de multiplication qui repose sur la réplication in vitro. On peut ainsi copier en de nombreuses copies un fragment d’ADN. Avec la PCR on fait des réplications à la chaîne, et pour borner la séquence à coder on utilise 2 amorces en 3’.

Le clonage fait intervenir un fragment d'ADN et un plasmide qui est une séquence d'ADN circulaire. Au cours du clonage, nous avons réalisé les étapes suivantes :                                   - la digestion : lors du quelle le fragment d’ADN va être découpé pour obtenir un insert et le vecteur pour que l'insert se lie à l'ADN circulaire pendant la ligation.                                                                                                                              - la transformation : qui permet d’insérer le plasmide recombinant dans la bactérie. 

- le test blanc-bleu : afin de différencier certains plasmides qui ont étaient envoyer dans la bactérie.                                                                                                                                         

- une électrophorèse : qui permet de vérifier la digestion.

Résultats et discussions :

Etape 1 et 2 : La digestion met en jeu des enzymes de restrictions, ils vont permettre de découper le fragment d’ADN en plusieurs fragments de différentes tailles.

[pic 1]

Étape 3 : Nous chauffons les solutions avec les enzymes de restriction afin que ces derniers arrêtent leur activité.

Étape 4 : Nous réalisons l’étape de la ligation, des plasmides sont recombinants d'autres se sont relier sans insert, les inserts ne trouvent pas de plasmides et il arrive que des liaisons phosphodiesters ne soit pas terminés. Lors de la ligation, une enzyme appelée ligase, permet de faire des liaisons phosphodiesters entre les nucléotides des deux extrémités si elles sont compatibles.

Étape 5 :

 [pic 2]

Sur cette électrophorèse on peut voir que l’on a une alternance entre les puis similaire. Dans le puits 1 on a le témoin qui permet de mesurer la taille des fragments, le puits 2 est vide pour faire également office de témoin.  On observe en 3, 5, 7 des bandes assez lisibles qui se ressemble. Pareil pour les puits 4,6 et 8 nous avons une répétions. Nous avons donc des séries de bandes qui se répètent. Les puits marqués par des flèches sont mes résultats. L'électrophorèse nous a permis d'identifier les types de fragments que nous avons obtenue lors de la digestion. Cependant cette étape est généralement faite avant la ligation, pour s'assurer que l'étape précédente ait durée suffisamment longtemps, lors du TP par manque de temps nous avons effectué cette étape après la ligation.

Étape 6 : Cette étape qui est la transformation, permet, grâce à un choc thermique, d’introduire les plasmides obtenus dans une bactérie, plus précisément, dans son cytoplasme. Les tubes sont mis dans la glace, afin de mettre en place le contact entre l'ADN et les bactéries. Ainsi l'ADN est chargé négativement et la membrane des bactéries qui est constituée de lipides montre une charge positive. Ainsi les ADN se lient à la membrane. Par la suite, on procède au choc thermique, ce qui permet à la membrane de s’ouvrir afin de laisser le plasmide passer et se retrouver dans le cytoplasme, pour ensuite faire la division cellulaire.

Étape 7 :

 [pic 3][pic 4][pic 5]

Lors de cette étape nous avons étalés les bactéries et les plasmides sur des boîtes de pétris contenant un milieu nutritif, de l’antibiotique et un substrat permettant la réaction colorée. On observe que la première boite est composée de 263 colonies bleues et 204 blanches.                 Contrairement à la première boîte, la seconde boite contient plus de bactériophage λ, on observe 62 colonies bleu et 86 colonies blanches.                                                                Enfin, dans la troisième boîte ne contient pas de bactériophage λ. On observe 317 colonies bleues et 121 colonies blanches. Normalement on aurait dû observer une absence de colonies blanches. Cette présence de colonies blanches peut-être dû à une mutation mais le grand nombre de colonies nous montre qu’il s’agit d’une erreur de manipulation.

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