Activation et analyses enzymatique de la chymotrypsine.

Travaux Pratiques d’Enzymologie

Activation et analyses enzymatiques de la chymotrypsine

La digestion des protéines est dépendante d’enzymes protéolytiques. Parmi ces enzymes, la chymotrypsine fait partie, avec la trypsine et l’élastase, des protéases à sérine. Ces trois enzymes ont le même mécanisme d’action, elles clivent les protéines, dans l’intestin grêle, en hydrolysant leurs liaisons peptidiques. Elles sont nommées « protéases à sérine » car elles possèdent toutes les trois une zone caractéristique, appelée triade catalytique et composée de trois résidus : sérine, histidine et acide aspartique.

La chymotrypsine possède ainsi cette triade catalytique lui permettant son activité protéasique. Cependant, cette enzyme est sécrétée, par le pancréas, sous une première forme inactive appelée chymotrypsinogène. Une fois dans l’intestin, elle est activée par l’action de la trypsine qui brise la liaison Arg 15- Ile16.

Ainsi activée, la chymotrypsine clive les liaisons peptidiques dont le carbonyle appartient à un L-acide aminé aromatique (tyrosine, tryptophane et phénylalanine), soit à un L-acide aminé non aromatique hydrophobe.

L’objectif de ce TP est d’activer le chymotrypsinogène par l’action de la trypsine et de caractériser l’activité de la chymotrypsine ainsi activée, vis-à-vis du Bz-Y-pNa qui est un substrat pour cette enzyme, cette caractérisation se fait en absence et présence d’inhibiteur. Enfin, le site actif de cette chymotrypsine, suite à son interaction avec la proflavine est analysé par spectrophotométrie.

Principes et méthodes

Principe de la spectrophotométrie

La spectrophotométrie est une technique d’analyse quantitative permettant la mesure de l’absorbance d’une substance, en l’occurrence d’une enzyme. Cette méthode repose sur l’utilisation d’un spectrophotomètre. Cet appareil permet de générer une lumière monochromatique de longueur d’onde choisie. Cette lumière traverse ensuite une cuve qui contient la substance à étudier. Alors, l’appareil donne l’absorbance correspondant à la longueur d’onde utilisée.

SSchéma de la spectrophotométrie dans le cas de la chymotrypsine

Principe de la chromatographie d’affinité

La chromatographie d’affinité sur colonne permet de purifier une substance en séparant les différents composés.

Dans une colonne, un gel se situe sur la paroi, il est couplé à un ligand spécifique de la substance à éliminer. La solution à purifier est déposée dans la colonne et un seul composé de cette solution est spécifique du ligand, contenu dans la colonne.

Une fois la solution à purifier déposée, il faut ajouter un tampon d’élution qui permet d’éluer la solution non retenue par colonne (donc toute la solution sauf le composé spécifique du ligand). Le mélange ainsi récolté est donc purifié.

Principe de l’électrophorèse

Le principe est de séparer des molécules selon leur charge nette grâce à un champ électrique. En effet, les molécules portent des groupements ionisables qui induisent une mobilité.

Dans le cas de l’électrophorèse en gel de polyacrylamide en présence de S.D.S (dodécylsulfate de sodium), le SDS est un agent dénaturant qui agit sur les liaisons hydrophobes et électrostatiques. Le SDS est amphiphile et l’hybridation de son groupement chargé permet au complexe SDS-protéine de rester soluble dans le milieu. En se liant à la protéine, le SDS empêche son repliement et lui confère une charge négative (la charge initiale de la protéine est complètement masquée).

Cette propriété du SDS est utilisée dans la séparation des chaines polypeptidiques en fonction de leur masse moléculaire uniquement. La technique repose sur deux conditions :

le SDS permet de masquer la charge des protéines, elles ont donc toutes une charge équivalente

les protéines se déplacent à travers un support fait de gel réticulé, de polymères d’acrylamide et de N-N méthylène-bis-acrylamide. La porosité de ce support dépend du dosage en acrylamide et en bis-acrylamide et permet, sous l’influence du champ électrique, un tamisage moléculaire. Les protéines de petite taille migrent plus vite que celles de grande taille puisque ces dernières sont retenues dans le maillage du gel.

Afin que la migration s’effectue en fonction du poids moléculaire, la protéine doit être dénaturée. Le DTT (dithiothréitol) est l’agent réducteur utilisé couramment utilisé pour rompre les ponts disulfures qui peuvent exister entre les chaines polypeptidiques de certaines protéines et maintenir les protéines dans leur état réduit. Il peut aussi être remplacé par un autre agent réducteur comme le β-mercaptoéthanol.

Suite à la dénaturation, une coloration au bleu de Coomassie est effectuée. Des protéines de référence migrent en parallèle pour servir de témoin. Pour déterminer le poids moléculaire d’une chaine polypeptidique il suffit alors de comparer sa distance de migration avec celles des protéines de référence, grâce à une relation linéaire existant entre la distance de migration des protéines et le logarithme de leur masse moléculaire.

Protocole expérimental

Premier jour

Activation du chymotrypsinogène en chymotrypsine et test de l’activation

20 mg de chymotrypsinogène nous ont été fournis, nous les avons solubilisés dans 2 mL de tampon d’activation (tampon tris HCl 50 mM pH 8.0 ; NaCl 100 mM ; CaCl2 50 mM).

Suite à cela, nous avons prélevé 10 µL de la solution pour doser l’activité de la chymotrypsine (parallèlement, un aliquot de 30µL de chymotrypsinogène a été conservé).

Pour activer le chymotrypsinogène, nous avons dû ajouter 0.2mg de trypsine pour une solution de chymotrypsinogène à 10 mg/mL, c’est-à-dire 0.100 µL d’une solution de trypsine à 2 mg/mL.

L’activation en chymotrypsine a été suivie par spectrophotométrie en mesurant l’apparition de l’activité chymotrypsique par intervalles de 5 minutes, pendant 25 minutes, c’est-à-dire jusqu’à ce que l’activité de la solution devienne stable.

...