Étude de l'effet de l'acide Gibbérélines sur la synthèse d'Alpha-Amylase par une graine d'orge

Introduction :

L’orge, Hordeum vulgare est une angiosperme de la famille des poacées. La graine de l’orge est riche en albumen, lieu de stockage de l’amidon. L’amidon constitue les réserves de glucides destinées à nourrir l’embryon lors de la germination de la graine. En effet, l’embryon ne possède pas de tissus photosynthétiques et ne peut utiliser que des sucres simples tels que le glucose pour sa nutrition. Afin d’utiliser les ressources de l’albumen, il a donc besoin d’enzymes spéciales, telles que l’α-amylase, qui catalyse l’hydrolyse de l’amidon en glucose, le rendant ainsi disponible. On sait que plusieurs phytohormones contrôlent la synthèse des ces enzymes.

Au cours de cette étude, nous chercherons à déterminer l’effet d’une phytohormone de la famille des gibbérélines : l’acide gibbérélique, noté AG3, sur la synthèse de l’α-amylase et donc son importance dans l’utilisation des ressources de l’albumen par l’embryon de la graine d’orge. Au cours de ces manipulations, nous réaliserons également un dosage biologique d’une solution d’acide gibbérélique (solution X) afin d’en déterminer sa concentration.

Nous effectuerons cette étude en trois étapes. Premièrement, nous ferons une observation à la loupe ainsi qu’au microscope optique, d’une graine d’orge en présence de lugol. La graine d’orge sera observée en coupe longitudinale. Ensuite, nous procèderons audosage colorimétrique du glucose dans des solutions d’AG3 à différentes concentrations (étude quantitative) puis à la mise en évidence de la présence d’amylase dans un échantillon d’incubât (étude qualitative).

Matériel et méthodes :

Observation d’une graine d’orge :

Nous observons une graine d’orge en coupe longitudinale à l’aide d’une loupe binoculaire, ainsi qu’au microscope optique. La coupe observée au microscope optique sera préalablement traitée au lugol afin de colorer les structures possédant de l’amidon. Nous ferons un dessin d’observation de cette coupe dans la figure 1.

Dosage colorimétrique des sucres réducteurs (glucose) :

Nous préparons 8 tubes contenant chacun 8 fragment de graines d’orge dont l’embryon a été éliminé afin de limiter l’apport d’AG3 endogène. Les manipulations se font en milieu stérile pour ne pas contaminer les échantillons par des bactéries qui pourraient consommer le glucose et ainsi fausser la manipulation. Les tubes 1 à 5 contiennent 4mL de solutions d’acide gibbérélique de concentrations différentes (respectivement : 1.10-6 g/mL, 1.10-7 g/mL, 1.10-8 g/mL, 1.10-9 g/mL, 1.10-10 g/mL). Les tubes 6 et 7 correspondent aux deux témoins mis en place : l'un contenant de l’eau et des fragments de graine sans embryon, le second contenant de l’eau et des fragments de graine avec leurs embryons. Le tube 8 contient la solution X à doser. Afin d’obtenir ces concentrations, nous réalisons des dilutions en cascade à partir d’une solution d’AG3 à 1.10-6 g/mL. Les dilutions sont faites avec de l’eau stérile.

Tableau récapitulatif des différents constituants des tubes et de la dilution en série des solutions :

On laisse les différents tubes en incubation dans une étuve à 30°C pendant 48h. Après suppression des fragments de grains, les incubâts sont alors centrifugés 5 minutes à 4000tr/min afin d’obtenir une surnageant épuré de particules inutiles de la graine. 0,5 mL de chaque surnageant est chacun ajouté à 2mL d’eau distillée dans des tubes à hémolyse. 0.1 mL de chaque solution est prélevée dans un microtube.

En parallèle, une gamme étalon de glucose est préparée à partir d’une solution mère de concentration de 150 µg/mL. Nous préparons 7 microtubes de 0.1 mL de solutions de glucose à différentes concentrations (dilution de raison 2). Pour réaliser le dosage colorimétrique, on ajoute à chaque solution 1mL de réactif de Biotrol. La réaction s’effectue pendant 10 minutes dans un bain marie de 37°C. On mesure alors les différentes absorbances à une longueur d’onde de 505 nm. A partir des données, nous pouvons tracer une courbe étalon de l’absorbance en fonction du glucose (figure 2) qui nous servira à tracer la courbe de la concentration de glucose des incubâts en fonction de la concentration d’AG3 (figure 3).

Mise en évidence qualitative de la présence d’amylase :

Nous réalisons maintenant une expérience visant à mettre en évidence la présence d’amylase dans un de nos incubâts réalisés. Pour cela, 0.3 mL d’empois d’amidon à 0.3% est ajouté à 1 mL de surnageant de notre incubât à 1.10-8 d’AG3. On dépose alors 150 µL du mélange dans un des puits de la plaque de test, en présence de 30 µL de lugol. L’expérience est répétée au bout de 5, 10, 20 et 30 minutes. Deux témoins sont également réalisés. L’un contient de l’eau et du lugol tandis que l’autre contient de l’empois d’amidon et du lugol.

Résultats et interprétations :

Observation d’une graine d’orge

La figure 1 représente un dessin d’observation d’une coupe longitudinale de graine d’orge observée à la loupe binoculaire (Gx40) et au microscope optique (Gx400). Nous pouvons en dégager ses principales caractéristiques. La graine mesure environ 6 à 7 mm de long pour 3 mm de large. Elle se compose en majeure partie d’albumen, contenant des amiloplastes, (lieu de stockage de l’amidon), puis d’un embryon. Ces structures sont entourée de trois assises de cellules formant la couche à aleurone, où est synthétisée l’α-amylase qui servira à catalyser la dégradation de l’amidon en sucres simples tels que le glucose. Enfin, un tégument ainsi qu’un péricarpe enveloppent l’ensemble de la graine et jouent un rôle de protection. Nous sommes donc en présence d’une graine riche en réserve nutritive qui serviront à nourrir l’embryon lors de la germination.

Dosage colorimétrique des sucres réducteurs (glucose) :

Dans cette partie, nous avons réalisé donc réalisé une gamme étalon, et ainsi, une première courbe (figure 2). Celle-ci nous permet de mesurer graphiquement la concentration en glucose dans les 8 tubes contenant les surnageants issus de la centrifugation. Pendant la manipulation, nous avons dilué nos solutions par 5 en ne prenant que 0,1 mL sur des solutions de 0,5 mL pour les mélanger au Biotrol. Il faut donc multiplier par 5 les différentes

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