Virologie L3 Bio

Introduction :

La virologie a développé, depuis son apparition, de nombreuses méthodes d’étude permettant de mettre en avant certains phénomènes et de comprendre le fonctionnement des virus.

Les virus sont des parasites acaryotes obligatoires, c’est à dire qu’ils ont besoin d’une cellule pour se répliquer et qu’ils ne possèdent pas de noyau.

Lorsque les virus sont sous forme extra-cellulaire, nous les appelons “virions”. Ils présentent alors une structure particulaire, et contiennent un type d'acide nucléique (ADN ou ARN) englobé dans une capside protéique. De plus, certains virus possèdent une enveloppe.

Les formes intra-cellulaires des virus se multiplient par réplication de leur matériel génétique (ADN ou ARN) en détournant activement la machinerie cellulaire.

Les Densovirus sont de petits virus entomopathogènes à ADN simple brin ambisens totalement inoffensifs envers l’homme et les vertébrés.. Ils sont classés dans la famille des Parvoviridae et dans la sous-famille des Densovirinae. Nous retrouvons chez ces virus 4 protéines structurales qui forment la capside notées VP1, VP2, VP3 et VP4. Chez les chenilles Spodotera frugiperda, le virus JcDNV traverse la barrière intestinale puis infecte et se multiplie dans les trachées et les cellules épidermiques. 4 à 8 jours après l’infection initiale, l’hôte meurt.

Au cours de ces TPs, nous avons donc utilisé les différentes techniques fondamentales de virologie permettant la préparation d'un stock de virus. Nous avons ainsi amplifié le virus JcDNV dans les chenilles après infection par deux méthodes différentes : per os (reproduction de l’infection naturelle) ou par injection directe dans l’hémolymphe des chenilles. Dans notre cas, nous avons travaillé sur des chenilles infectées par injection directe.

Manipulations :

Différentes étapes ont été nécessaires afin de parvenir à obtenir un stock de notre virus :

1. Amplification du virus JcDNV dan des chenilles Spodoptera frugiperda (effectué en laboratoire)

2. Purification du virus amplifié

3. Vérification de la qualité du virus purifié par microscopie électronique en transmission.

4. Dosage du virus purifié par PCR quantitative

5. Analyse des protéines de structure du virus par SDS-PAGE et western blot.

Amplification du virus :

- Principe et Objectifs :

Le virus JcDNV a été amplifié dans les chenilles en utilisant deux méthodes différents :

- per os (par voie orale) qui permet de reproduire l'infection naturelle.

Pour cela les chenilles Spodoptera frugiperda sont nourries avec de la nourriture contaminée par du virus purifié. Les indivudus morts de l'infection sont collectés et congelés.

- par injection en injectant directement le virus dans l'hémolymphe des chenilles, outrepassant alors la barrière intestinale et se multipliant ensuite dans les trachées et les cellules épidermiques des chenilles. Les indivudus morts de l'infection sont collectés et congelés.

Ces chenilles sont ensuite utilisés pour la purification du virus.

Purification du virus :

- Principe et Objectifs :

Les chenilles mortes de l'infection ont été broyées dans du tampon TE 1X. Le broyat a ensuite

été clarifié par une centrifugation à 10 000g. Les virus ont alors été purifiés sur filtre : nous avons passé le surnageant clarifié dans un filtre de 0,22 μm afin d'enlever les débris.

Plusieurs dilutions du virus filtré ont enfin été réalisés (10-1 à 10-5).

Ces dilutions seront utilisés pour le dosage des virus par PCR quantitative, ainsi que pour l'analyse des protéines.

Dans un même temps, une purification par ultracentrifugation isopycnique en gradient de rénographine a été réalisée en laboratoire afin de comparer l'efficacité de ces deux méthodes. C'est une méthode de séparation en gradient continu, les molécules soumises à la centrifugation dans le gradient se sépareront selon leur densité, et non pas leur masse. Cette technique sépare les particules de densités différentes sous forme de bandes indépendamment du temps de centrifugation (une fois l'équilibre atteint).

- Résultats et discussion :

Il est nécessaire d'attendre les résultats de la PCR pour avoir les quantités de virus obtenus après

purification sur filtre.

Pour la purification par ultracentrifugation isopycnique en gradient, les résultats nous ont été donnés directement, soit : 5 x 1012 génome/μL.

Nous pourrons après avoir exploiter les résultats obtenus par PCR, comparer l'efficacité des deux techniques de purification.

Observation du virus purifié par microscopie électronique en transmission :

- Principe et Objectifs :

Nous avons observé nos virus purifié par microscopie électronique en transmission.

Pour cela, il a été nécessaire de déposer nos échantillons de virus sur une grille métallique recouverte d'un film de collodion-carbone, et constrastés en utilisant la technique de coloration négative.

Nous avons immergé cette grille dans une goutte de virus (pur ou dilué au 1/10ème), puis successivement dans deux gouttes d'acide phosphotungstique à 2%.

L'acide phosphotungstique est un contrastant qui permet une coloration négative (visible par un marquage noir) en microscopie électronique à transmission du fait qu'il est opaque aux électrons de part sa densité.

Nous pouvons alors analyser la qualité des virus purifiés à l'aide d'un microscope électronique. Ce type de microscopie utilise un faisceau de de particules d'électrons pour illuminer un échantillon et ainsi en créer une image très agrandie (jusqu'à 300 000X).

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