Technique d'extraction

Summary OMEE (Anjard)

Partie 1 et 2 : Préparation des acides nucléiques

Rappel de la structure des acides nucléiques

Sucre = ribose (ARN) 2’-désoxyribose (ADN)

+ Base = Purine (Guanine, Adénine) Pyrimidine (Cytosine Uracile Thymine)

Les acides nucléiques forment des polymères commençant par un phosphate en 5’ et finissant par un OH en 3’. 3 liaisons entre C et G, 2 entre A et T (U).

Les séquences des deux brins sont complémentaires et d’orientation antiparallèle.

Plasmide forme : linéaire, relâchée ou sous forme superenroulée.

Méthodes d’extraction et de séparation des acides nucléiques

• Étapes : Lyse pour libérer et solubiliser les acides nucléiques + élimination chimique ou enzymatique des contaminants (déprotéinisation = phénol/chloroforme) + précipitation ADN (Sels + éthanol ou isopropanol). ADN dans phase aqueuse si pH > 7.5, ARN si <5.
• Autres méthodes : purification sur colonne échangeuse d’anions, purification sur colonne de silice, ultracentrifugation (gradient de densité en chlorure de césium)

Comparaison des méthodes

Quantification et analyse des acides nucléiques

• Mesure du spectre UV : absorption maximal à 260 nm pour l’acide nucléique, 280 nm pour les protéines. Dans certaines limites cette absorbance est directement proportionnelle à la concentration en ADN (pour 1A 260 concentration ADN db 50g/ml). Utilisation du rapport A260/A280 pour la pureté (=2 si pure car ADN absorbe 2 fois moins a 280)
• Electrophorèse (ADN et ARN) en gel d’agarose + détection au BET (agent intercalant un fluorochrome)

La distance de migration et fonction de la taille => marqueur de taille et courbe étalon.

Présentation des enzymes utilisées en biologie moléculaire

• Endonucléases de restriction : enzyme coupant au milieu de la chaine. Coupure à bouts francs ou coupure à bouts cohésifs (5’ ou 3’ sortant)

Site de restriction = séquences palindromiques

• Méthylase : ajoute un groupement méthyle (sur nucléotide empêche coupure).
• ADN polymérase : synthétise le brin d’ADN complémentaire sens 5’ => 3’

+ Activité exonucléase : coupe ADN à partir d’une extrémité sens 3’ => 5’ ou inversement qui corrige les erreurs.

Ex : ADN pol 1, fragment de Klenow, T4 pol, T7 pol, Teq pol.

+ Conversion de sites de restriction (remplissage ou élimination d’extrémités)

• Méganucléase = endonucléase avec sites de restriction entre 12 e t40 pb
• Transposase/recombinase/flipase : échanges de brins d’ADN au niveau des sites de restriction => excision, inversion, échange.
• Terminale transférase : catalyse l’addition de désoxynucléotides (choix aléatoire) sur une fonction 3’OH terminale de l’ADN. Souvent utilisée avec 1 seul nucléotide.
• Reverse transcriptase : Les transcriptases réverses sont des DNA polymérases qui peuvent synthétiser un brin d’ADN complémentaire (ADNc ou cDNA) en prenant un ARN comme matrice0
• Ligase : besoin ATP, relie deux fragments nucléotidiques (5’P avec 3’OH)
• Phosphatase : remplace un groupement (5’) P par un (5’) OH
• Kinase : remplace un groupement OH par un P via 3eme P de l’ATP
• RNase : dégrade l’ARN en nucléotide libre => purifie ADN
• ProtéinasK : dégrade les protéines en acides aminés

Partie 3 : Détection et identification des acides nucléiques

Principe de l’hybridation moléculaire

Dénaturation ADN (chauffage > Tm : moitié db moitié sb, agents dénaturants), refroidissement => hybridation.  Hybridation en solution ou en support solide.

Objectif : détecter une séquence nucléique (petite) par l’utilisation d’une sonde

Facteurs influençant l’H : % G-C, [ADN], T°, force ionique, complexité des séquences.

Type de sondes et de marquages

• Sonde = petite séquence d'ADN ou d'ARN marquée (par un composé fluorescent, un radio-isotope ou une enzyme) que l'on utilise pour hybrider et détecter des séquences homologues, c'est-à-dire complémentaires. Les sondes doivent être spécifiques et sensibles. Sonde ADN classique > 100 pb et Oligonucléotide < 50 pb (autorise moins de mismatch)
• Types de marquage : chaud (radioactif) ou froid (direct : nucléotide modifié par un fluorochrome, indirect : nucléotide marqué par un reporter qui sera repéré par une molécule affine). Marquage externe ou interne.

Isotopes radioactifs : 32P 33P 35S 3H haute sensibilité et quantification mais dangereux.

Fluorochromes : lié chimiquement à un oligonucléotide qui servira d’amorce à la sonde ou nucléotide avec marqueur directement intégré. Fluorescence à certaine longueur d’ondes. Stable et reproductible mais cout élevé, sensibilité et efficacité variable.

Marquage indirect à la dioxygénine : D incorporée dans la séquence ADN sous la forme de dUTP-digoxigénine le plus souvent. Et on utilise ensuite un anticorps qui reconnaît spécifiquement la D. Anticorps couplé à une enzyme et cette enzyme va engendrer une réaction colorée (échantillon +). Stable mais sensibilité et efficacité variable

Marquage indirect par couplage avec une enzyme : sonde synthétisé avec dNTP modifié avec biotine. Après hybridation la biotine est localisée par la streptavidine couplée à une enzyme comme la phosphatase alcaline (utilise son substrat et donne un précipité visible). Haute sensibilité, bon marché mais irréversible et bruit de fond.

Détection non radioactive par couplage à une enzyme : La chimiluminescence est un phénomène de réaction chimique ayant pour conséquence la production de lumière. Substrat + cofacteur + catalyseur => produit + lumière. Stable, haute sensibilité mais bruit de fond parfois élevé et signal non linéaire

Marquage externe en 5’ par phosphorylation : 3eme P radio de l’ATP transféré grâce à une kinase

Marquage externe en 3’ par ajout de nucléotide : incorporation de nucléotide dont le 1er P est radio grâce à une terminale transférase.

Marquage interne (coupure/rebouchage) : digestion ménagée donnant des coupures dans les sb de l’ADN puis action ADN poly I qui rebouche et déplace la coupure avec nucléotides marqués (dCTP).

Multi-amorçage au hasard : dénaturation sonde -> hybridation d’amorces au hasard -> polymérisation brins complémentaires avec nucléotides marqués (dCTP).

...