Compte-rendu TP lipides "extraction du jaune d'oeuf".

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1. But

Le but de ce TP est de déterminer la composition lipidique d’un jaune d’œuf. Pour cela, on réalise une extraction des lipides du jaune d’œuf pour, par la suite les déterminer à l’aide de deux chromatographies sur couche mince en comparant leurs migrations à celles de lipides témoins. Ces méthodes reposent sur leur différence de solubilité, les lipides étant solubles dans les solvants organiques, et leur différence de polarité.

1. Principe

L’extraction des lipides : 
Dans un premier temps, nous effectuons l’extraction des lipides contenus dans le jaune d’œuf qui est lyophilisé. Nous mettons environ 50mg de jaune d’œuf lyophilisé dans un tube à essai puis on ajoute 1mL du mélange chloroforme/méthanol (2:1) préalablement introduit dans un second tube à essai, 2mL de chloroforme et 1mL de méthanol mélangés grâce au VORTEX. On sait que les lipides sont miscibles avec la phase organique donc on obtient après décantation:

• Une première couche appelée le surnageant qui est constitué de lipides et de solvant organique.
• Une deuxième couche appelé le dépôt qui est constitué des autres composants de ce jaune d’œuf lyophilisé (= les protéines).

Les 2 chromatographies sur couche mince (CCM) :
Dans un second temps, nous effectuons deux chromatographies. La CCM est une chromatographie d’adsorption, basée sur les différences d’interactions des substances à l’égard de deux phases :

• une phase stationnaire solide fixée sur une plaque de gel de silice, qui est absorbante, cette phase est polaire.
• une phase mobile liquide (éluant) qui est constituée par un solvant ou un mélange de solvant : c’est la phase apolaire.

Pour la première chromatographie sur couche mince, la phase mobile contient 20 mL de solvant hexane/éther diéthylique/acide acétique (70:30:1). Afin d’introduire les solvants dans de bonnes mesures nous devons calculer le rapport 20/101 (total des trois solvants) = 0.200, puis faire le produit de ce résultat avec les proportions indiquées dans l’énoncé soit :

• Dans la cuve pour la chromatographie

• Hexane : 70 x 0.200 = 14mL
• Ether Diéthylique : 30 x 0.200 = 6mL
• Acide Acétique : 1 x 0.200 = 0.2mL

Pour la seconde chromatographie sur couche mince, la phase mobile contient également 20 mL de solvant dichlorométhane/méthanol/eau (65:25:3), 20/93 = 0.200 soit :

• Dans la cuve pour la chromatographie

• Dichlorométhane : 65 x 0.200 = 13mL
• Méthanol : 35 x 0.200 = 5mL
• Eau : 3 x 0.200 = 0.6mL

Les produits sont déposés sur la ligne de dépôt de la phase stationnaire à l’aide de capillaires différents pour chaque produit. Chaque dépôt est constitué de plusieurs gouttes de produit car certains étant très volatils, il faut s’assurer que chaque produit est assez présent sur les plaques pour réagir. Nous avons fait 2 dépôts à différentes concentrations pour les extraits de jaune d’œuf pour identifier si la concentration en produit joue un rôle dans la migration.

Produits de la CCM1 :

• Acide Gras (2 dépôts)
• Monoacylglycérol (4 dépôts)
• 1,3-Diacylglycérol (4 dépôts)
• 1,2 Diacylglycérol (4 dépôts)
• Triacylglycérol (4 dépôts)
• Extrait du jaune d’œuf (2 dépôts)
• Extrait du jaune d’œuf (5 dépôts)
• Cholestérol (8 dépôts)
• 1,3-Diacylglycérol (2 dépôts) + 1,2 Diacylglycérol (2 dépôts)
• 1,3-Diacylglycérol (2 dépôts) + 1,2 Diacylglycérol (2 dépôts) + Cholestérol (4 dépôts)
• Ester de Cholestérol (4 dépôts)
• Phosphatidylcholine (8 dépôts)
• Phosphatidyléthanolamine (8 dépôts)

Produits de la CCM2 :

• Monoacylglycérol (8 dépôts)
• Cholestérol (8 dépôts)
• Extrait de jaune d’œuf (2 dépôts)
• Extrait de jaune d’œuf (5 dépôts)
• Phosphatidylcholine (8 dépôts)
• Phosphatidyléthanolamine (8 dépôts)

• On laisse migrer le solvant jusqu’à 1cm du bord supérieur de la plaque, puis on la sort de la cuve et on trace le front du solvant. Une fois le solvant totalement évaporé (grâce à un séchage de notre part), on place la plaque dans une solution révélatrice de lipides.
• La révélation se fait en 3 étapes, toutes durent 10min, grâce à la coloration par le bleu de Coomassie, puis par décoloration (au chlorure de sodium). Puis on sèche la plaque pour l’analyser.
• Suite à la révélation, nous avons pu observer le résultat de nos deux CCM.

Le principe de la chromatographie est le suivant, la phase mobile (solvant ou mélange de solvant) migre vers le long de la phase stationnaire (plaque de silice). Cette phase mobile, lors de sa migration, entraine avec elle les produits qui ont été préalablement déposés sur la ligne de dépôt au niveau de la phase stationnaire. La vitesse de migration de chaque produit lui est propre c'est-à-dire que chaque produit ne migre pas en même temps, également, la hauteur de la migration sur la phase stationnaire dépend du produit.

L’explication à cela est le fait que ces deux phénomènes dépendant de l’affinité du produit avec les deux phases. La distance parcourue par le solvant lors de sa migration est définie par le rapport frontal (Rf) caractérisé par la relation :                Rapport frontal
Chaque tâche sur la CCM désigne un constituant que l’on identifie grâce à son rapport frontal que l’on compare avec celui d’un témoin.[pic 4]

1. Résultats et interprétation :

• Calcul des références frontal (Rf) :

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