Stage Labo in Vivo 2019

COMPTE RENDU DU STAGE LABO IN VIVO.

Introduction

La bactérie Candidatus Kuenenia stuttgartensis est une bactérie anammox très étudiée et qui est retrouvée presque partout. Des recherches au Pays-Bas ont été déjà faites pour obtenir un séquençage complet du génome de cette bactérie.

Les Bactéries Anammox sont capables d'effectuer en aérobie l’oxydation d’ammonium. Les bactéries Anammox sont utilisées dans le traitement des eaux usées pour éliminer l'ammonium (où est Nitrite???) des eaux usées et jouent un rôle important dans le cycle biologique de l'azote .Les besoins de la bactérie pour sa survie sont l’ammonium, le nitrite et le C02.

Dans le stage du cadre de l’UE Labo In Vivo, on a accompagné un bout de projet centré sur l’étude d’une protéine particulière de la bactérie anammox à Complexe constituée d’une sous-unité Flavine et à centre fer/Soufre. Cette protéine est impliquée surtout dans le transport d’électrons : cela contribue à la construction des gradients de protons reliées à l’ammonium et au nitrite et fait aussi tourner l’ATPase. Pour comprendre certaines fonctions de cette protéine, on a eu donc à isoler cette protéine en effectuant son clonage dans le plasmide de E.coli.

Jour 1 : 18-02-2019

Technique 1 : Préparation du milieu de culture des bactéries E.Coli.

Principe : Un milieu de culture est une préparation, contenant des substances (biologiques ou chimiques) qui reproduit un environnement (nutriments, pH, pression osmotique) permettant à certains types de micro-organismes de se multiplier.

Il existe une grande variété de milieux de culture qui sont utilisés pour produire, conserver, isoler ou identifier certains micro-organismes.

Mode opératoire.

Préparation de 2 Milieux avec dans chacun :

900ml de milieu bacterien+100ml de tampon phosphate.

Préparer le tampon phosphate de côté sans le mélanger au milieu car le phosphate peut précipiter en formant des complexes avec des ions.

Anaérobiser le milieu bactérien et le tampon par l’azote et la pompe à vide.

Stérilisation

La stérilisation peut être effectuée de 2 façons :

Microfiltration qui consiste à laisser passer les petites bactéries.

Chauffage / autoclavage 120° pendant 20 min. On va utiliser le chauffage dans notre cas.

Apres, s’en suit la décongélation de nos bactéries E.coli (Kust d 1483 et Kust e 4570) pour une pré culture. Pour cela on effectue la préparation de 2 milieux (LB) également moins enrichis que les 1ers qu’on a préparés :

Mode opératoire :10ml de milieu bact+10µl de amp+10µl de kan??? en veillant au maintien de la stérilité dans le périmètre (bec bunsen) chauffé.

Pre-culture prête+ Incubateur37°c à 180 tours/min (sur la nuit).

On a constaté un changement de notre pré culture qui est trouble ce qui prouve la croissance bactérienne.

Ensuite s’effectuent successivement un ajout de tampon phosphate, des antibiotiques et du fer + ajout de notre pré culture avec seringue dans le milieu bactérien préalablement préparé.

Laisser 5jours à 20°c pour une croissance bactérienne.

Résultats :

On a effectué ensuite une récolte des bactéries pour la culture : 

 Visualisation de notre échantillon au microscope optique, ce qui a révélé notre E.coli transparente en forme de bâtonnets 3fois plus grandes en longueur, parfois en forme de bâtonnets penchés témoignant d’une division bactérienne ,Par la suite on a voulu quantifier en nombre nos bactéries; 

Dans un premier temps on a effectué la mesure de l’absorbance sur les bactéries cultivées à 37°c afin de nous donner une idée sur la proportion bactérienne dont les résultats sont : 

Mesure de l’absorbance à 600nm 

Kust d 1483 

1,6 

Kust e 4570 

1,56 

Commentaire : En jouant sur la concentration en bactéries, on a pu jouer sur l’absorbance. En effet , l’absorbance diminue lorsqu’on diminue la concentration.  

JOUR 2 :19-02-2019

Technique 2 : Synthèse de minéraux (et réaction redox en jeu)

La fougerite est un minéral naturel de la rouille verte, décrit relativement récemment .Fougerite a d' abord été trouvé dans les sols forestiers près de Fougères , Bretagne , France et reconnu comme une espèce minérale validé par l' Association internationale de minéralogie . Il est bleu-vert-gris bleuté en couleur, et ressemble à des minéraux argileux à l' habitude , formant des plaquettes hexagonales en MEB. Dans cet environnement, il donne des rapports globaux variables Fe 2+ : Fe 3+

L’objectif du travail est ainsi de pouvoir le synthétiser. Le travail se fait alors en anaérobie pour éviter le contact des solutions avec l’oxygène à l’aide d’une boite à gants.

Pour cela on dispose de FeS04 et de FeCl2 et de solution de Na OH

Mode opératoire :

50ml de H20 mélangées à 1,93g de FeS04

25ml de H20 mélangées à 0,93g de FeCl2

A ces 2 solutions, ajouter respectivement 20ml et 10ml de Na OH

Observations

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