Isolement et purification des entérobactéries

Nom : Benaouf.                                                                                                                           13-11-2017

Prénom : Salima.

Groupe : A2.        

Tp N : 01 de biochimie et physiologie microbienne

Isolement et purification des entérobactéries

[pic 1]

1. Objectifs du TP :

-Dénombrement de la flore bactérienne d’un prélèvement de sol forestier et agricole.

-Isolement et purification des entérobactéries.

-Identification des colonies bactériennes (entérobactéries) sur le milieu EMB.

1. Principe :

     A partir d’un échantillon de sol prélever stérilement  on réalise l’ensemencement sur milieu de culture solide EMB(permet la présélection des souches isolées d’entérobactéries)  et  GN (permet une multiplication non sélective des bactéries), l’ensemencement se fait après réalisation des suspensions de dilution en cascade ceci permettra l’isolement des microorganismes présents.

L’incubation des milieux ensemencés permet le développement des germes en colonies leur dénombrement s’effectue grâce à un compteur de colonies cela permettra d’estimer la quantité de germe contenue dans le sol.

   Enfin ; on réalise un criblage et une purification des entérobactéries ensemencés sur EMB à partir de colonie d’allure différente ; on procèdera ensuite à l’étude morphologique macroscopique et la détermination du type d’entérobactérie.

1. Résultats, et observations :

• Dénombrement de la flore bactérienne non exigeante et des entérobactéries :

      Afin de dénombrer la flore microbienne sur le milieu solide il faut considérer chaque colonie ou clone visible comme un microorganisme parce que certains microorganismes peuvent être pluricellulaires. On utilise le terme UFC (unité formant colonie) afin de rapporter les résultats obtenus ; la comptabilisation se fait grâce à  un compteur de colonies, on ne prend en compte que les boites contenant entre 30 à 300 colonies.

[pic 2]

Appareil de dénombrement des colonies

Les résultats obtenus sont rapportés sur les tableaux suivants :

SOL AGRICOLE

Solution mère = 5g de sol humide dans 50mL d’eau physiologique stérile.

[pic 3]

 POUR LE MILIEU EMB :

     Afin d’effectuer le calcul nous devons prendre en compte que les dilutions contenant entre 30 et 300 UFC, mais dans ce cas aucune valeur obtenu pour les dilutions correspondantes n’est incluse dans l’intervalle donc les calculs ne devraient pas être fait, mais à titre comparatif entre les valeurs pour les deux sols on va quand même les faires ; on va prendre la plus grande valeur c’est celle qui correspond à la dilution 10-1 .N (nombre de colonie comptés )= 6.5  UFC/0.1 ml de la dilution :

• N = 6.5 UFC/0.1ml de la dilution [pic 4]

Le nombre de colonies (UFC) par 1 ml de la dilution :[pic 5]

• N = 6.5 x 10 = 65 UFC/1ml de la dilution [pic 6]

Le nombre de colonies (UFC) par 1 ml de la solution mère :

• N = 65 x 10 = 650 UFC/1 ml de la solution mère

Le nombre de colonies (UFC) par 50 ml de la solution mère :

• N = 650 x 50 = 32500 UFC/50 ml de la solution mère

      Ce chiffre représente le nombre total des entérobactéries dans 5g du sol agricole humide. Afin de trouvé le nombre par gramme de sol  sec on divise ce chiffre par 4.952g.

Le nombre de colonies (UFC) par 1g de sol :

               Poids sec du sol : 4.952g

               On a : 4.952  g             32500 UFC [pic 7]

                             1g                         N ? [pic 8]

                N= 32500/4.952

               N = 6563.01 UFC/ 1g de sol

POUR LE MILIEU GN :

  On effectue le dénombrement pour la boite de dilution 10-1 car elle représente le nombre le plus élevé comprit dans l’intervalle [30-300] UFC avec N (nombre de colonie comptés)= 61.5 UFC/0.1 ml de la dilution :    .

Le nombre de colonies (UFC) par 1 ml de la dilution :[pic 9]

• N = 61.5 x 10 = 615 UFC/1 ml de la dilution [pic 10]

                 Le nombre de colonies (UFC) par 1ml de la solution mère :

• N = 615 x 10 = 6150 UFC/1 ml de la solution mère

Le nombre de colonies (UFC) par 50ml de la solution mère :

• N = 6150 x 50 = 307500 UFC/50ml de la solution mère

Ce chiffre représente le nombre total des bactéries non exigeante dans 5g du sol agricole dilué..

Le nombre de colonies (UFC) par 1g de sol : le calcul s’effectue par rapport au poids sec du sol : 4.952g

      4.952g           307500 UFC [pic 11]

             1g                    N [pic 12]

N = 307500/4.952

N = 62096.122 UFC/ g de sol.

POPULATION BACTERIENNE DES ENTEROBACTERIES PAR RAPPORT A LA POPULATION MICROBIENNE DU SOL  :

                   GN         100%[pic 13]

        EMB           P  %[pic 14]

...