TP Transformation pour transgénèse

Transformation pour transgénèse :

Dans ce TP nous voulons tester la méthode de transformation d’un gène. La transformation est le mécanisme de transfert d’acides nucléiques entre cellules procaryotes. On utilisera pour cela un plasmide qui est un ADN circulaire automatiquement présent chez les bactéries. On utilise la souche de bactérie E.coli HB 101 K – 12 que l’on veut rendre fluorescente par le plasmide pGLO. La fluorescence sert notamment à observer le développement de bactéries dans les organismes infectés.

Fig 1 : Schéma du plasmide pGLO

PBAD est le promoteur de GFP qui s’exprime seulement lorsque le complexe AraC + Arabinose est présent.

Les UV vont permettre de révéler la fluorescence si elle s’exprime.

Etapes importantes :

Ajout d’une solution de transformation (CaCl2) aux 2 tubes (+ pGLO et – pGLO) à l’aide d’une pipette de transfert stérile.

Cela permet de neutraliser les charges négatives du plasmide.

Ajout de plasmide dans un seul des deux tubes, l’autre sert de témoin.

Choc thermique : bain-marie, réglé à 42°C, pendant exactement 50 secondes puis de nouveau dans la glace pendant 2 minutes.

Cela permet de fragiliser les membranes et permet la transformation.

Ajoutez du milieu nutritif LB dans les tubes. Les tubes sont incubés pendant 10 minutes à température ambiante.

Etape importante car il faut laisser le temps à la bactérie d’initier la fabrication de la β-lactamase qui permettra l’expression du plasmide.

Résultats attendus et observés :

Boite + pGLO LB/amp : on s’attend à avoir une croissance des colonies sans fluorescence car le gène de résistance à l’ampicilline a été introduit et s’exprime cependant l’absence d’arabinose empêche l’expression du gène de fluorescence GFP. Cette boite permet de vérifier que la transformation à bien eu lieu.

Boite + pGLO LB/amp/ara : On s’attend à de la croissance et de la fluorescence, en effet contrairement à la boîte ci-dessus la présence d’arabinose permet l’expression du gène GFP par la formation d’un complexe araC + arabinose qui permet l’activation du promoteur PBAD. Cette boite permet de vérifier que l’expression du gène GFP a bien lieu et donc que nous pouvons suivre le développement de la bactérie par sa fluorescence.

Boite – pGLO LB/amp : On s’attend à ne pas observer de colonie car les bactéries n’ont pas pu acquérir le gène de résistance à l’ampicilline. Cette boite permet de vérifier que la souche utilisée est bien sensible à l’antibiotique.

Boite – pGLO LB : On s’attend à observer la croissance des colonies sans fluorescence. Cette boite permet de vérifier que la souche de bactérie est viable.

Remarque : Dans la boite de gauche (LB amp) on n’observe pas de

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