Evaluation de l’activation des lymphocytes T CD4 chez la souris rapportrice Nur77-GFP

Titre : Evaluation de l’activation des lymphocytes T CD4 chez la souris rapportrice Nur77-GFP

Résumé :

Observation de l’activation lymphocytaire TCD4 via l’utilisation d’une souris rapportrice Nur77 dans laquelle le niveau de protéine fluorescente GFP reflète la force d’activation dû à l’antigène. On utilise une rate de souris Nur77 pour récupérer ces cellules immunitaires et plus particulièrement ces lymphocytes. On va les mettre en présence d’anticorps CD3 qui vont se fixer sur le TCR et activer les lymphocytes. On va ensuite laver et ajouter des anticorps anti-CD4 permettant de sélectionner ensuite les anticorps CD4 grâce à un fluorochrome APC fixé à son extrémité qui une fois excitée sera capable d'émettre de la lumière. En utilisant cette méthode nos résultats montrent que l’activation des lymphocytes CD4 est induite par des concentrations croissantes d’antigène.

Résultats : Analyse grâce au logiciel Floreada : [pic 1]

• On sélectionne les cellules d’intérêt en discriminant les cellules ayant un diamètre (FSC) et une granulosité (SSC) trop importante. En prenant en compte les propriétés connues sur les lymphocytes : c'est-à-dire une petite taille et pas de granule.

• On analyse les cellules d'intérêts en mesurant la longueur d’onde des CD4 via la fluorescence des anticorps marqués à l'APC par apport à la longueur d’onde des cellules émettant du GFP.
• Création d’un dot plot afin de pouvoir sélectionner les CD4+
• À l'aide de statistiques on a sélectionné les cellules qui sont à la fois CD4+ et GFP. .

[pic 2]

• Vos résultats bruts (dot-plots GFP vs CD4) :

On observe que 3,75% des cellules sont marquées à la fois pour le GFP et à la fois pour le CD4+ et donc que 3,75% des cellules sont des lymphocytes T CD4+ activé.

Nous avons ci-dessous les résultats statistiques obtenus en fonction des différentes concentrations de CD3, c’est à dire en fonction du dégrés d’activation lymphocytaires. On peut voir que moins on aura de CD3 et donc d’activation lymphocytaires, moins on aura de CD4 activé. Cependant nos résultats ont vraiment fonctionner que pour les 3 premières dilutions , il y a donc eu une erreur dans les dilutions en série.

[pic 3]

 [pic 4]

[pic 5]

- La détermination de l’activation cellulaire en fonction de la concentration en anticorps :

Le pic le plus à droite est celui ayant la concentration d’anticorps apaggnan CD3 la plus importante (la moins dilué). Plus les pics vont vers la gauche plus la concentration mise d’anticorps CD3 est faible. Ici nous allons seulement tenir compte des 3 derniers pics car nous avons sûrement dû faire une erreur dans les dilutions lors de notre expérimentation. L’activation des lymphocytes T est quantifiée par l’expression de la GFP.

Plus on met d’anticorps CD3 plus on va avoir d’activation du TCR et donc plus on va avoir d’activation des lymphocytes T.

[pic 6]

Discussion :

L’utilisation d’une souris transgénique permet de pouvoir visualiser l’activation lymphocytaire via le TCR directement via la présence de GFP, on n’aura donc pas besoin d’utiliser de fluorochrome spécifique. Cette méthode est avantageuse car elle permet un gain de temps sur le long terme en diminuant le nombre de manipulations et donc permet de limiter les erreurs humaines étant associé à ces manipulations. De plus, la GFP augmente seulement lorsque le lymphocyte est activé via le TCR et n’est pas activé par des stimuli inflammatoires, montrant seulement les effets de la fixation de CD3 sur le TCR. Étant une méthode de biologie moléculaire, il se peut que l’insertion de la GFP ne se fasse pas au bon endroit ou qu’elle subisse des mutations entraînant son inactivation, dans ce cas on obtiendrait des résultats totalement incohérents.  

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