Dosage des protéines du sérum

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DOSAGE DES PROTÉINES DU SÉRUM[pic 2]

Respect des consignes, des horaires, des délais, propreté de la paillasse et présentation du compte- rendu. (2 points)

Le but de ce TP est d’illustrer la séparation et l’analyse des protéines du sérum.

Dans un premier temps, la séparation des protéines du sérum est réalisée par relargage par le sulfate d’ammonium. Puis une électrophorèse en conditions dénaturantes et réductrices permet la visualisation du contenu de la fraction protéique obtenue après la séparation et la comparaison avec le sérum. Un dosage par la méthode du Biuret permet une quantification des quantités de protéines obtenues.

I Principes du relargage des protéines par le sulfate d’ammonium, de la séparation et des méthodes analytiques utilisées.

La solubilité d’une protéine est fonction de la force ionique du milieu. Ainsi, si on essaye de dissoudre des protéines dans de l’eau distillée, la plupart du temps elles forment une sorte de colle. Par contre si on ajoute graduellement au milieu un électrolyte (NaCl par exemple), la protéine va progressivement se dissoudre jusqu’à atteindre un maximum de solubilité pour une concentration précise d’électrolyte, caractéristique de la protéine dans des conditions données (température, pH). Si on continue à augmenter la concentration en électrolyte, la protéine précipite, on dit qu’il y a « relargage ». Pour chaque protéine, à un pH donné, il existe une concentration en sel pour laquelle il y a précipitation totale, c’est la zone de relargage.

L’effet de relargage est utilisé pour précipiter les protéines les unes après les autres par addition de quantités croissantes de sel. Le sel le plus utilisé est le sulfate d’ammonium car il ne dénature pas les protéines.

Pour réaliser un relargage, il faut donc :

• Ajuster la concentration en protéines de la solution par dilution dans une solution de NaCl 0,15 M.
• Amener cette solution à la concentration désirée en sulfate d'ammonium (soit par le sulfate d'ammonium cristallisé, soit à l'aide d'une solution saturée en sulfate d'ammonium)
• Ajuster au pH choisi.

Ainsi, une partie des protéines du sérum sera éliminée après relargage par le sulfate d'ammonium à 50% de saturation, à pH 7. Le sulfate d’ammonium est ensuite éliminé de la fraction albumine par passage sur une colonne PD 10 (colonne de dessalage par filtration sur gel).

L'albumine obtenue sera ensuite analysée par deux méthodes :

• Électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-PAGE)
• Dosage par spectrophotométrie par la méthode du Biuret.

Le principe de la méthode du Biuret est le suivant : une solution fortement alcaline de sulfate de cuivre (réactif de Gornall), ajoutée à une solution de protéine, entraîne la formation d'un complexe entre l'ion cuivrique et les liaisons peptidiques, avec l'apparition d'une coloration violet-pourpre (réaction du Biuret). Le maximum de cette coloration se situe à 540 nm et il y a proportionnalité entre l'intensité de la coloration et la quantité pondérale de protéines présente dans le milieu. L'étalonnage des dosages colorimétriques sera effectué par une solution d'Albumine de Sérum Bovin (BSA) de concentration connue (la BSA est en effet classiquement utilisée comme protéine de référence).

En parallèle, l’analyse des protéines contenues dans le sérum sera effectuée selon les mêmes méthodes.

II Précipitation des globulines.

Dans un tube à centrifuger, mesurer exactement la prise d'essai de sérum (1mL). Compléter le volume à 2,5 mL avec une solution de NaCl 0,15M. Ajouter ensuite 2,5 mL de solution de sulfate d'ammonium 4,5 M, goutte-à-goutte, en agitant à l’aide d’un vortex afin d'éviter une coprécipitation pouvant entraîner l'albumine. Vérifier que le milieu est bien à pH 7 à l'aide d'un papier indicateur universel. Centrifuger 10 minutes à 3500 tours/min puis prélever le surnageant.

En parallèle, préparer une solution de sérum dilué (S1) dans un tube à hémolyse. Pour cela, prélever 0,5 mL de sérum et y ajouter 3 mL de NaCl 0,15M.

Le tableau I en annexe donne les propriétés caractéristiques de quelques protéines du sérum humain ainsi que leur zone de relargage.

Q1 : Schématisez cette expérience (1 point)

[pic 3]Le surnageant est prélevé par centrifugation

Q2. Quel est le rôle du (NH4)2SO4 ? (1 point)

Le sulfate d’ammonium est un sel utilisé en précipitation de protéines comme la solubilité des différentes protéines varie fortement avec la concentration de sels. Cela permet de séparer les protéines entre elles

Q3. À quelle concentration finale de (NH4)2SO4 le relargage est-il effectué ? (1 point)

 Ci( sulfate d’ammonium 4.5M) Vi(volume de sulfate d’ammonium) =CbVb(volume total)

Cb= 4.5 x 2.5.10^-3/5.10^-3

= 2.25 M

Q4. À partir du tableau en annexe 1, indiquer quelles protéines du sérum précipitent et quelles protéines ne précipitent pas à cette concentration finale de (NH4)2SO4 ? Aidez-vous des deux questions posées en annexe 1. (2 points)

Les protéines suivantes : Haptoglobine, glycoprotéine acide (orosomucoïde)+ 1 antitrypsine, Céruléoplasmine, 1 Macroglobuline, Transferrine, Immunoglobulines précipitent à cette concentration de sulfate d’ammonium

Il n’y’a que l’albumine qui ne précipitent à cette concentration de sulfate d’ammonium donc elle précipite à plus de 50% de (NH4)2SO4

Q5. Préciser ce que contiennent le surnageant d'une part, et le culot de centrifugation d'autre part. (1 point)

Le surnageant contient l’albumine salé + sulfate d’ammonium. Tandis que le culot contient les globulines précipitées

1. Passage sur colonne PD 10 (domaine de fractionnement 1000-5000 Da).

La colonne PD 10 est équilibrée avec une solution aqueuse d’éthanol 20%. Vider la colonne en laissant couler le liquide dans un flacon poubelle.

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