ARN

Une dernière technique de déplétion des ARNr ressemble à la précédente : c’est la ribodéplétion basée sur les anticorps grace au kit GeneRead depletion kit. On a d’abord une hybridation de sondes oligonucléotides ADN avec les ARNr. Les hybrides ADN-ARN, au lieu d’être reconnu par les RNaseH dans la méthode enzymatique, sont reconnu par des anticorps et forment un complexe anticorps hybride. L’IgG de l’AC sera ensuite reconnu par des billes qui recouverte de protéine G, ces billes sont magnétiques, elles seront retenues sur une colonne. Une élution permet de récupérer tous les ARN sauf les ARNr, qui seront retenu magnétiquement sur la colonne.

Dia 8 : Pour dépléter l’ARNm de globine il y a une technique principale qui est très largement utilisée, elle se base sur le même principe d’hybridation et de purification par des billes magnétiques vue pour la déplétion d’ARNr. Elle se fait grâce au kit GLOBINclear. Des oligonucléotides spécifiques de l’ARNm de la globine sont produits et ils sont biotinylés. Il faut mettre en contact l’échantillon avec les oligonucléotides pour streptavidines, qui vont reconnaitre la biotine. Finalement, grâce à un aimant, les billes vont être attirées au fond du tube, on peut alors récupérer le surnageant qui ne contient (presque) plus d’ARNm de globine.

Ces techniques peuventêtrefaites dans les deux sens c’est-à-dire qu’on peutdéplèter d’abord les ARNr puis ensuite les ARNm ou inversement.

Le but ici est de dépléter à la fois les ARNr et les ARNm de globine, si on utilise deux kits séparés pour retirer l’un puis l’autre il y a des soucis de contamination qui vont entrer en jeu car plus on ajoute d’étape à une manipulation plus la pureté est compliquée à garder. Pour cette raison, des entreprises ont développer des kits qui permettent la déplétion d’ARNr et d’ARNm de globine simultanément.

Dia 9 :

Un des kits est le NEBNext Globin & rRNA. On aura deux types d’oligonucléotides qui vont produits : ceux spécifiques des ARNr et ceux spécifiques des ARNm de globine. Ils vont s’hybrider sur leur cible et ensuite la RNAse H va dégrader l’ARN et la DNAse I les sondes ADN comme pour la méthode enzymatique vu précédemment. Ainsi on a dépléter les deux types d’ARN en même temps.

Un autre kit est disponible par Illumina et se nomme Globine Clear Gold Removal Kit, il se base sur la déplétion d’ARNr et d’ARNm de globine par les méthodes de billes magnétiques. Ce sont exactement les mêmes techniques que décrites juste avant, mais réalisées en même temps car ce kit contient des oligonucléotides biotinylés spécifiques des ARNr, et des oligonucléotides biotinylés spécifiques des ARNm de globine dans la même solution. Grace a cette biotinylation il y aura interaction avec les billes de streptavidine. Ainsi on pourra depelter les ARNr et ARNm en meme temps en aimant ces billes pendant l’élution.

Dia 10 :

Toutes les techniques ont leurs avantages et leurs inconvénients,

On va commencer par la déplétion par la queue polyA, c’est une technique rapide, mais elle montre un rendement faible dû aux nombreuses étapes de lavage. Par ailleurs l’utilisation de cette méthode permet de récupérer uniquement

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