Techniques immunologiques

Techniques immunologiques

• FACs : Fluorescence Actived Cell Sorter

Est une technique immunologique. Elle correspond à la cytométrie en flux. Permet d’obtenir des informations cellulaires importantes. Le cytomètre en flux est capable de trier les cellules que l’on veut → trie cellulaire. On peut donc faire de la population et donc sélectionner la population que l’on veut. Les anticorps sont des marqueurs spécifiques de marquage que ce soit en recherche clinique ou fondamentale. La chambre de flux, on met les échantillons en suspension et on les fait passer dans une chambre de flux qui permet de les faire passer une à une. Les cellules peuvent être marqué de différentes couleurs avec un anticorps, on marque simplement la protéine de surface. L’anticorps est couplé à un fluorophore (vert, bleu et rouge généralement). On peut donc contrôler l’homogénéité. On récupère ensuite la population que l’on veut (on trie par couleur les cellules).

A la sortie, on est capable de sélectionner différents types cellulaires qui correspond au marquage cellulaire effectué. Et correspond à la cellule que l’on veut avec le marquage de surface que l’on a effectué (marqueur de surface pour les récepteurs des cellules). Cela marche par diffraction de la lumière. On peut donc choisir le marqueur de surface.

Exemple : on a utilisé deux marqueurs de surface lymphocytaires (anticorps anti CD3 fluorescéine et AC anti CD8 couplé à la rhodamine). Les petites cellules vont partir car les lymphocytes sont plus gros. On est capable de sortir des populations qui sont un homogénat de cellules. Le FACs permet de sélectionner des populations homogènes qui permet de tirer des conclusions. Ensuite on peut changer les contraintes et en obtenir une seule population homogène. Le FACs sert à obtenir une population uniquement homogène. L’avantage est qu’on peut utiliser des populations contrôle. On regarde les récepteurs de surface qui s’exprime et donc on peut faire des marqueurs de surface qui vont permettre de voir s’il s’agit d’un anticancéreux…

Si on fait la même expérience sur plusieurs cellules on ne peut pas tirer de conclusion car certaines cellules vont l’exprimer et d’autre pas.

• Intérêts

• Analyse du cycle cellulaire :

Permet le suivi des cellules dans les différentes phases du cycle de division en fonction de différents stimuli ou de l’ajout de différentes drogues.

• Evaluation de la présence de protéines membranaire 

sur des cellules vivantes : utilisation de marqueurs spécifique… les marqueurs doivent être membranaire et les cellules doivent être vivantes.

• Détection de cellules pathologiques

Avantage : on est sur des cellules vivantes, on peut donc travailler ensuite dessus : remettre en culture, étudier l’ADN…

• Tri de cellules vivantes selon l’expression des marqueurs

• Immunoprécipitations

• Chromatographie d’affinité

Chromatographie d’affinité : dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est un support macromoléculaire chimiquement inerte sur lequel est greffé un effecteur qui présente une affinité biologique pour un soluté de l’échantillon à analyser.

3 types d’affinités sont utilisés :

• Affinité enzyme-substrat
• Affinité ligand-récepteur
• Affinité antigène-anticorps

Très souvent, la molécule fixée sera le substrat, le ligand ou bien l’anticorps. Ceci permettra de purifier l’enzyme, le récepteur ou l’antigène, respectivement.

• Autres techniques de purification

Résine couplée à des lectines : purification par les sucres : Ac sont des glycoprotéines

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