Technique d'isolation des protéines

                                   Introduction

La connaissance des protéines a connu une évolution considérable à partir de 1960, grâce à l’introduction des méthodes relevant de diverses approches disciplinaires et par le développement technologiques.

Les protéines sont des polymères d’acides aminées qui régissent la plupart des fonctionnements vitaux des êtres vivant autrement dit ce sont des molécules à la base du vivant. Si on envisage d’étudier une protéine (sa structure et ses mécanismes d’action), il est d’emblée indispensable de procéder à la purification de cette protéine. Toutefois, en raison de la variation de la taille, la charge et la solubilité dans l’eau des protéines, une seule technique ne peut suffire à isoler chaque sorte des protéines. L’isolement d’une protéine donnée parmi des milliers des protéines contenus dans une cellule est une tache délicate qui nécessite des techniques à la fois pour séparer les unes des autres, pour purifier, pour détecter et pour caractériser cette protéine. L’étude d’une protéine repose donc sur l’extraction des protéines d’un matériel biologique donnée, puis leurs séparations par centrifugation, chromatographie. En outre il faut doser la protéine en question pour avoir une meilleure pureté afin de la caractériser enfin par spectrométrie de masse, électrophorèses.

Comment est ce qu’on procède alors à l’isolement des protéines ? Une fois la protéine isolée comment faire pour la purifier et la caractériser ?

Nous allons d’abord présenter les différentes techniques d’isolement. Puis nous allons décrire les techniques de purification qui permettent d’avoir une protéine pure. Enfin , nous allons terminer par éclaircir plusieurs techniques destinés à caractériser la masse d’une protéine et sa séquence

Techniques d’Isolement

1. Centrifugation

Un protocole classique de purification protéique commence par la centrifugation. La centrifugation est une technique de séparation mécanique, par action de la force centrifuge, de deux à trois phases entraînées dans un mouvement de rotation. On peut séparer deux phases liquides, une phase solide en suspension dans une phase liquide, voire deux phases liquides contenant une phase solide.

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Principe de centrifugation

La centrifugation est une technique qui consiste à séparer des molécules de taille et de masse très variable présente dans un liquide. Tout les molécules contenus dans un échantillon sont soumis à la gravité, force qui s’exerce du haut vers le bas, et le force qui s’exerce du bas vers le haut, poussée d’Archimède. Ces deux forces sont parfaitement équilibrés qu’ils permettent qu’avec les temps   tous les constituants finissent par tomber au fond du récipient dans lequel, ils se trouvent (sédimentation) ou remontent à la surface. C’est d’ailleurs ce qui arrive pour certains. Mais pour la majorité d’entre eux, un autre phénomène intervient qui empêche ce résultat : agitation moléculaire.

-La plupart des cellules possèdent des organites différents et variés. Si on envisage  l’étude  d‘une fonction particulière des protéines, il faut d’abord isoler  l’organite approprié à l’état purifié.  Les cellules sont d’abord brisées par rupture mécanique dans une solution tamponnée isotonique (contenant souvent du saccharose) à l’aide d’un homogénéisateur mécanique qui empêche la rupture, par osmose, des vésicules membranaires. L’homogénat est ensuite soumise à une série de centrifugations séquentielles. Au début, l’homogénat est soumise à de faible force centrifuges de court période de temps de manière à le sédimenter, sous forme de dépôt (le culot), que les plus gros organites cellulaires, les noyaux (et tout les cellules restées intactes). Des forces centrifuge simultanée  permettent de sortir de gros organites situent dans le cytoplasme en suspension (Mitochondrie, Chloroplaste, lysosome, réticulum endoplasmique…). Les étapes initiales de la centrifugation différentielle  ne donnent généralement pas de préparations pures d’un organite particulier ; c’est pourquoi il est nécessaire de procéder à d’autre étapes. Les organites cellulaires isolés par  centrifugation différentielle conservent remarquablement bien leurs activités normales, pour autant qu’ils ne soient pas exposés à une dénaturation au cours de leur isolement.

Centrifugation différentielle

Dans  ce type de centrifugation, le principe est de séparer les différents constituants le plus souvent à l'aide de plusieurs cycles de centrifugation à accélération croissante. Au départ on verse un homogénat cellulaire dans un tube que l’on soumet à une rotation avec une vitesse et à un temps au bout duquel les organites tels que les noyaux s’accumulent au fond du tube. Tous les autres éléments (pour lesquels l'accélération a été trop faible pour contrebalancer les effets de l'agitation moléculaire, ou pour lesquels le temps de centrifugation a été trop court) vont rester dans la fraction liquide appelée alors surnageant. Les solubles restent dans le surnageant. On récupère alors séparément le surnageant. Pour séparer des nombreuses protéines contenues dans ces surnageant, il est nécessaire d’utiliser d’autres techniques de purification Cette méthode est par exemple couramment utilisée pour récupérer les éléments figurés (les cellules) du sang qui sédimentent pour des accélérations très faibles (quelques dizaines de g).

Au besoin, on peut recommencer un second cycle de centrifugation avec le surnageant précédent, mais avec une accélération plus importante. Progressivement, on sépare ainsi les différents constituants en terminant pas les éléments les plus petits et ayant le moins de différence de densité avec le solvant. Précisons que les fractions obtenues sont généralement loin d'être pures, d'autant que les échantillons initiaux sont souvent complexes (exemple du broyat total d'un tissu). L'intérêt est justement de pouvoir traiter des échantillons très complexes, et ce sur des volumes importants avec des rotors adaptés.

La figure1 dresse une liste non exhaustive des constituants cellulaires et des valeurs d'accélération nécessaire pour les faires sédimenter.

b-Ultracentrifugation

    Ultracentrifugation est une méthode qui étudie la masse des macromolécules (protéine). Les macromolécules sont soumises au champ gravitationnel, ne démontre aucune évidence de sédimentation : Agitation thermique est suffisante à les garder  dispersées de façon homogène  et à moins qu’elles ne soient agrégées (associer).

Sauf, lorsque les macromolécules sont assujetties à des forces centrifuges successive qu’elles commencent à sédimenter. Avec cette technique, on peut démontre que les protéines sont des macromolécules de composition homogène et un grande nombre de protéines sont constituées des sous-unités. L’appareil utilisé est une ultracentrifugeuse inventée en 1923 par Theodor Svedberg, chimiste suédois.

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