Rapport de Biotechnologie

Introduction

Afin de mettre en pratique la théorie vue au cours de biotechnologie, trois séances de laboratoire ont été organisées. Elles sont réparties en trois manipulations, à savoir :

Manipulation 1 : Transformation de cellules compétente d’Escherichia coli par un plasmide

Manipulation 2 : Digestion du plasmide

Manipulation 3 : Electrophorèse du plasmide

L’objectif final de ces manipulations est de nous permettre d’observer le processus de transformation artificiel d’Escherichia. Coli.

Plus précisément, la première manipulation va consister à faire en sorte que la bactérie E. coli puisse accepter et intégrer à son génome un plasmide résistant à un antibiotique : l’ampicilline.

La seconde manipulation quant à elle consiste en la digestion du plasmide afin de préparer ce dernier à la troisième et dernière manipulation à savoir l’électrophorèse sur gel d’agarose.

La dernière partie de cette suite de manipulations va dès lors concerner l’analyse des résultats obtenus lors de chaque manipulation.

Table des matières

MANIPULATION 1

1. Introduction et objectif 3

2. Matériel 6

3. Mode opératoire 6

4. Résultats et interprétations 7

4.1. Résultats obtenus 7

4.2. Analyse des résultats 8

4.3. Evaluation du nombre de molécules de plasmides et du nombre de cellules bactériennes introduites au départ de manière à calculer le rapport numérique 9

4.4. Rendement de transformation exprimé en nombre de transformant par µg de plasmides et fréquence de la transformation, c'est-à-dire le pourcentage de cellules transformées par rapport au nombre total de cellules viables. 10

4.5. Estimation du taux de mortalité des cellules par le seul fait de la transformation. 12

5. Conclusion 13

MANIPULATION 2

1. Introduction et objectif 14

2. Matériel 14

3. Mode opératoire 14

4. Réflexions et calculs 15

MANIPULATION 3

1. Introduction et objectif 16

2. Matériel 18

3. Mode opératoire 18

4. Résultats et interprétations 19

5. Conclusion 21

Manipulation n°1 – Transformation de cellules compétente d’Escherichia coli par un plasmide

Introduction et objectif

L’objectif de cette manipulation est la modification génétique de la bactérie Escherichia coli afin de la rendre résistante à l’ampicilline qui est un antibiotique. Le but est également de voir dans quelle mesure le plasmide peut être intégré au sein d’E. coli et dans quelle mesure celui-ci peut conférer une résistance aux antibiotiques.

On utilise E. coli car il s’agit d’un organisme bien connu, qui se développe assez vite en laboratoire et dont la souche JM109 est une souche sensible à tout type d’antibiotique. Cette sensibilité va nous permettre à terme, à la fin du laboratoire, de pouvoir observer si les bactéries ont réussi ou non à recevoir le gène qui code pour la résistance aux antibiotiques.

Le gène qui nous intéresse lors de la manipulation est le gène bla, qui correspond à la béta-lactamase. La béta-lactamase est un enzyme capable d’hydrolyser béta-lactamine qui sont notamment présentes dans la famille des antibiotiques des pénicillines. En effet, le gène bla est capable d’ouvrir le site de béta-lactamine et donc inhiber l’action de l’antibiotique.

Il existe trois modes principaux de recombinaison génétique :

La transduction : processus qui consiste en un transfert de matériel génétique d’une à l’aide d’un vecteur viral, bactériophage. Ce transfert s’effectue d’une bactérie donneuse à une bactérie receveuse.

La conjugaison : méthode sexuée utilisée par les bactéries avec comme objectif un échange d’information génétique. La bactérie donneuse transmet ses plasmides de conjugaison à une bactérie receveuse à l’aide d’un pilus sexuel, permettant ainsi au plasmide d’être intégré dans le génome de la bactérie receveuse.

La transformation : méthode qui consiste en l’absorption d’un ADN nu et non associé à une cellule par une bactérie. Il s’agit d’un phénomène qui existe à l’état naturel et qui est courant chez les bactéries. Cette intégration d’un fragment d’ADN étranger va entrainer une modification héréditaire du phénotype de la bactérie.

Figure 3 : schéma de la transformation. (Caillet N., 2014)

Il faut remarquer qu’E. coli est une bactérie qui n’est pas apte à réaliser cette transformation de manière naturelle. Il faut donc utiliser un protocole capable de la rendre compétente artificiellement. Cela signifie qu’il faut qu’elle soit dans un état physiologique tel qu’elle puisse recevoir et accepter des fragments d’ADN nu par diffusion au travers de l’enveloppe cellulaire. Pour se faire, on utilise un traitement similaire par chlorure de calcium à une température de 0°C.

Dans le cas de figure qui concerne ce laboratoire, la méthode qui va être utilisée est donc le processus de transformation qui va consister en l’injection d’un plasmide nu au sein de la cellule. Le plasmide se trouve être une molécule d’ADN qui est bicaténaire et circulaire. Ce plasmide est présent chez les bactéries et les levures. Il s’agit d’une molécule bien distincte de l’ADN chromosomique. Le plasmide étant un élément génétique facultatif, il peut être modifié et ainsi réintroduit dans une cellule bactérienne hôte afin de servir de vecteur de clonage. Le plasmide qui va être utilisé ici est le pBR322 qui contient 4361 paires de

...