Transformation bactérienne.

RESUME :

Au cours de cette première séance de laboratoire, nous avons procédés à une transformation bactérienne pour pouvoir réaliser notre objectif final de clonage moléculaire. Le processus de transformation bactérienne implique plusieurs étapes, dans un premier temps il s’agit de rendre des bactéries compétentes (les bactéries doivent être compétentes pour être perméables à l’ADN, et pour pouvoir ainsi intégrer un plasmide - par un choc thermique - fournissant (dans notre cas) une résistance à l’ampicilline à la bactérie) ; cet état de compétence doit être ensuite vérifié par l’application d’un test de transformation (la sélection des transformants est permise par l’utilisation d’une gélose à ampicilline ne permettant la croissance que des bactéries ayant intégrées le plasmide) ; puis on peut alors conduire une réaction de polymérisation de chaîne permettant enfin d’avoir le matériel génétique nécessaire (la production du fragment d’ADNc qui sera cloné) au déroulement d’un clonage moléculaire en utilisant le vecteur pBluescript.

INTRODUCTION :

Principe de préparation des bactéries compétentes :

Le principe de préparation de bactéries compétentes repose sur la capacité de la bactérie à incorporer de l’ADN. Pour ce faire l’état physiologique des bactéries doit permettre une efficacité maximale de transformation c’est pourquoi on réalise une mise en culture sur un milieu LB afin d’obtenir des cellules venant de se diviser de multiples fois au cours de la phase exponentielle de leur cycle de croissance. http://eric.vinas.free.fr/IMG/pdf/compar_transfo_gfp.pdf. Le but de l’expérience est l’addition d’un ou plusieurs gènes étrangers au sein d’une cellule, ces derniers si exprimés peuvent conférer des nouvelles caractéristiques à la cellule. http://bioutils.unige.ch/experiences/expe_transfo_bact.php

Principe de la transformation bactérienne :

Le principe de transformation bactérienne consiste en un transfert de matériel génétique qui est fixé puis absorbé par des bactéries réceptrices dites en état de compétence. http://www.microbes-edu.org/etudiant/gene2.html. Les bactéries compétentes sont incubées dans une solution contenant du Ca2+ afin de permettre la formation de pores dans la membrane bactérienne masquant ainsi les charges négatives de l’ADN et permettant donc la fixation d’ADN aux membranes. L’insertion de l’ADN à travers les membranes est permis grâce au processus de choc thermique à l’origine d’un gradient thermique qui permet l’incorporation de l’ADN dans les cellules. Une technique plus récente appelée Electroporation est également utilisée : un courant électrique est responsable de la formation de « pores hydrophobiques » dans les membranes cellulaires dans lesquels l’ADN passe. L’ADN traverse les pores sans véritables interactions avec les composants membranaires ou, selon une deuxième hypothèse l’ADN et les composants lipidiques forment un complexe permettant alors l’incorporation de l’ADN dans les cellules. Green M.R., Sambrook J., Molecular Cloning (2012), P159

Sélection des transformants :

Il faut sélectionner  les bactéries transformées (celles comportant le plasmide recombiné). D’abord, on a un mélange de bactéries transformées contenant de plasmide d’intérêt et de bactéries non transformées dans nos tubes. Le fait d’étaler des bactéries sur une boite contenant un milieu gélosé et un antibiotique pourra nous montrer que seules les bactéries transformées pourront se multiplier car le plasmide porte un gène de résistance contre l’antibiotique. Chaque colonie est ensemble de bactéries identiques provenant de la division d'une bactérie. (www.normalesup.org/~diribarn/.../TechnoADNrecomb_AI-5-6.ppt)

Les bactéries sont incubées 45 min. Pendant cette période, les cellules ne se divisent pas mais « réparent » leurs membranes.

L’étape suivante consiste à étaler les produits de la transformation sur un milieu contenant de l’ampicilline pour éliminer les bactéries qui n’auront pas intégré le plasmide. On sélectionne donc les bactéries transformées. Mais dans ces bactéries on a des plasmides recircularisés et recombinés. Pour les différencier on fait un repiquage sur des boîtes de pétri. Les colonies qui ne se développent pas sur le milieu LB avec Ampicilline ont intégré pBluescript c'est-à-dire les plasmides recombinés

Le principe de la sélection des transformants basé sur le nombre de transformants générés par microgramme de plasmid d’ADN superenroulé utilisé pour la réaction de transformation permet de définir de l’efficacité d’une transformation bactérienne. http://www.sigmaaldrich.com/technical-documents/protocols/biology/transformation.html 

Matériel et Méthodes :

Génotype et caractéristiques de la souche de bactérie utilisée :

La souche E. coli DH10B a été utilisée pour l´amplification et la conservation des vecteurs plasmidiens. Son génotype est : F-, araD139 ∆(ara, leu) 7697, ∆lacX74, galU, galK, mcrA, ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), rpsL, dor, ø80dlacZ∆M15, endA1, nupG, recA1.

En effet, la souche DH10B d´E. coli est une bactérie compétente contient le fragment du gène lacZ codant pour la sous-unité β de la β-galactosidase, tandis que le vecteur contient le fragment codant pour la sous-unité α (gène lacZa). Lorsque la bactérie a été transformée par un plasmide non recombinant, les deux sous unités de la β-galactosidase sont produite et peuvent s´assembler (α-complémentation) (Ullman et al. 1967). L´enzyme dégrade alors le substrat chromogène X-Gal, ce qui se traduit par une coloration bleue des colonies. Lorsqu´un insert est présent dans le plasmide au niveau du site de clonage multiple, le

gène lacZa porté par le vecteur n´est plus fonctionnel. L´X-Gal ne peut plus être métabolisé et la colonie transformée reste blanche.

(Akram ADAM . Thèse présentée en vue de l´obtention du grade de Docteur en Sciences (Janvier 2008))

Caractéristiques du plasmide pBluescript :

Le pBluescript comprend seulement un site de restriction Barn HI dans le site de multiclonage. Le pBluescript possède un gène qui confère à la bactérie une résistance à l'ampicilline; le gène ampr .De plus, le pBluescript possède, dans le site de multiclonage, une partie du gène lac Z; une séquence qui code pour les 146 premiers acides aminés de l'enzyme -galactosidase (-gal). C'est le fragment  de la  -gal. Certaines souches d’E.coli, incluant les DH10B, possèdent une délétion au gène lac Z, mais la partie codante pour le domaine C-terminal de la  -gal est  présente. Le génotype des ces bactéries est  –gal _, c'est-à-dire, qu'elles ne peuvent pas produire l'enzyme  -gal actif. Lorsqu'un plasmide comme le pBluescript est inséré dans une bactérie  -gal-, la partie  de la  -gal (codée par le plasmide) ainsi que la partie C-terminal de la  -gal (produite par la bactérie) sont présentes et il y a formation de l'enzyme  -gal actif et les bactéries deviennent  –gal+. Cependant, lorsqu'un fragment d'ADN étranger est inséré dans le site de multiclonage du plasmide (plasmide recombiné) il n'y a pas formation de la partie  de la  -gal. Lorsque ce plasmide recombiné est inséré dans une bactérie  –gal _, il n'y a pas formation de la  -gal actif; les bactéries restent  -gal _ . En présence d'un substrat chromogène, le 5-bromo-4-chloro-indo1yl- -D-galactopyranoside (X-Gal), les bactéries  –gal+ métabolisent ce substrat et, par conséquent, ces colonies bactériennes deviennent bleues. Par contre, les bactéries  –gal _, en présence du même substrat chromogène, ne métabolisent pas ce substrat et restent blanches. C'est cette méthode de sélection dite « -complementation » qui a été utilisée pour sélectionner les cellules avec un insert.[pic 1][pic 2][pic 3][pic 4][pic 5][pic 6][pic 7][pic 8][pic 9][pic 10][pic 11][pic 12][pic 13][pic 14][pic 15][pic 16][pic 17][pic 18][pic 19][pic 20][pic 21][pic 22]

...