Techniques de purification

Nom :tang   

Prénom : kuan   

Groupe TP : E32

TP5 Techniques de purification   

1. Parmi les différents types de lyse cellulaire possible, laquelle choisiriez-vous, sachant que les protéines membranaires sont à conserver ? Justifier.   

Je choisirais d’utiliser du détergent puisqu’il permet la lyse des cellules en empêchant l’agrégation et en évitant la dénaturation des protéines.   

1. Toujours concernant les protéines membranaires à analyser, quelle précaution doit-on   

prendre tout au long des différentes étapes de purification et pourquoi ?   

Il faut maintenir la présence du détergent tout au long des différentes étapes. Pour que les protéines ne redeviennent pas insolubles et qu’elles forment des agrégats.   

1. Décrivez le SDS et expliquez son rôle dans la participation à la dénaturation des protéines. SDS signifie Sodium Dodecyl Sulfate, c’est une molécule chargée négativement, un détergent anionique. Il va recouvrir les protéines, les dénaturer en cassant leur structure tridimensionnelle et leur apporter des charges négatives.

1. En plus du SDS, quel est l’autre élément indispensable à la dénaturation des protéines en

vue d’une séparation par SDS-PAGE ? Justifiez.   

Pour dénaturer les protéines, il est aussi indispensable d’utiliser un agent réducteur tel que le β-mercaptoéthanol, en effet, il va rompre les ponts disulfures et ainsi participer à la dénaturation des structures tertiaires et quaternaires des protéines.

1. Pourquoi a-t-on besoin de mettre le gel sous tension électrique ? Justifiez.   

Le gel est mis sous tension électrique afin d’attirer les protéines et de les faire migrer. En effet, sous tension électrique, le haut du gel sera chargé négativement et le bas du gel sera chargé positivement, or, grâce au SDS, les protéines sont toutes chargées négativement, ainsi, un courant électrique va les faire migrer vers la borne positive du gel donc vers le bas. De plus, étant toutes chargées négativement, elles migreront uniquement en fonction de leur taille.   

1. Décrire ces étapes.   

Une foie la migration terminée, on plonge le gel dans un bain de coloration contenant du bleu de Coomassie, de l’éthanol, de l’acide acétique et de l’eau. Le bleu de Coomassie a de l’affinité pour les acides aminés basiques et aromatiques, il va donc colorer spécifiquement les protéines. Une fois que le gel est bleu, on le plonge dans un bain décolorant contenant de l’éthanol, de l’acide acétique et de l’eau. Ainsi, après quelques minutes, on va voir apparaitre des bandes colorées correspondant aux protéines.

1. Avec quoi, ou comment, calibre-t-on un gel SDS-PAGE ? A quoi correspondent les numéros 1 à 10 ?   

Pour calibrer un gel SDS-PAGE, on dépose dans un des puits, ici le premier, des marqueurs de masse moléculaire, ce sont des protéines dont on connait la masse moléculaire et qui vont ainsi nous permettre d’estimer avec approximation la masse moléculaire des protéines placées dans les autres puits. Les numéros 1 à 10 correspondent aux différentes protéines dont on connait la masse, allant de celle ayant la masse moléculaire la plus importante (la 1 avec ici 130 kDa) à celle ayant la plus petite masse moléculaire (la 10 avec ici 10 kDa).   

1. Expliquez où vont migrer les protéines des pistes 2 à 5 sur le gel SDS-PAGE de la figure au dessus. Ce gel permet une séparation de protéines comprises entre 10 kDa et 130 kDa. Pour la piste 2, la protéine A fait 17 kDa, elle va donc migrer entre les marqueurs

moléculaires 8 (20 kDa) et 9 (15 kDa). Pour la piste 3, la protéine B fait 30 kDa, elle va donc migrer entre les marqueurs moléculaires 6 (34 kDa) et 7 (25 kDa) Pour la piste 4, la protéine

C fait 66 kDa, elle va donc migrer entre les marqueurs moléculaires 3 (72 kDa) et 4 (55 kDa) Enfin, pour la piste 5, on va observer 3 bandes correspondants au 3 protéines, une entre les marqueurs 3 et 4, une autre entre les marqueurs 6 et 7 et la dernière entre les marqueurs 8 et 9.   

1. La séparation des protéines en gel SDS-PAGE dépend-elle des charges intrinsèques des   

protéines ? Justifiez.   

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