Technique biologique

Techniques biologiques.

Outils pour la Cytologie et l’histologie – Etude des principales techniques.

Quelques définitions.

• Cytologie : Etude microscopique de cellules isolées.
• Histologie : Etude microscopique de tissus biologiques. Par exemple, observation de l’oignon.
• Microscopie : « micro » = petit + « copie » = examiner.

On ne peut pas voir en-dessous de 1mm.

Quelques notions sur la vision.

• Vision humaine limitée par le pouvoir séparateur de l’œil.
• Pouvoir séparateur = capacité à séparer visuellement deux objets distincts.

• Pour une vision de 10/10 pouvoir séparateur = angle 1/60ème de degré.

        Permet de distinguer deux points éloignés de 0,1 à 25cm.

• Pour une vision de 1/10ème 

        1mm vu à 25cm de distance.

Intérêt de la microscopie.

• Plus la distance d’observation est grande, plus les détails devront être grands pour pouvoir être observés : 1mm à 2,5m ; 1cm à 25cm, etc.
• Etude histologique à l’œil nu permet de distinguer :

• La couleur,
• La forme,
• La taille,
• L’aspect général.

• Etude microscopique viendra compléter : examen des cellules.
• L’utilisation d’appareils grossissants est donc intéressante.

1. Loupes

1. Observation à la loupe à main.

Loupe à main : Outil utilisé pour augmenter le pouvoir séparateur de l’œil.

• Composé d’une lentille biconvexe qui dévie les rayons lumineux.
• 10 x < Grossissement < 20 x (grossissement entre 10 et 20).
• Pour garder une trace de l’observation faite, utilisation d’un appareil photo possédant un objectif macro.

1. Observation à la loupe binoculaire.

Loupe binoculaire : possède une lentille objectif près  de l’objet à observer.

• Possède deux lentilles oculaires près des yeux.
• 10 x < Grossissement < 300x (grossissement entre 10 et 300).
• Pour garder une trace de l’observation faite, utilisation d’une binoculaire avec appareil photo.
• Utiles pour la réalisation de dissections fines. On peut y faire des dissections plus précises, rechercher des parasites sur le scarabée. etc.
• Observation le plus souvent de la surface des objets.
• Pour l’observation d’organismes peu pigmentés et transparents, possibilité d’observer l’extérieur et l’intérieur de l’individu. On peut essayer de voir l’intérieur d’organismes transparents, comme les larves de poissons, etc.
• Utilisation d’une lumière épiscopique ou diascopique.

Episcopique (épi = sur) : Permet d’observer des objets opaques en couleur en leur donnant un effet plus naturel.

Diascopique (dia = à travers) : Convient davantage à des échantillons translucides et transparents. Procure un meilleur contraste que l’épiscopique.

1. Microscopie photonique.

Microscopie photonique = microscopie optique : Technique d’observation d’objets par l’utilisation d’un microscope dans lequel un faisceau de photons (de lumière) éclaire l’objet.

• Basé sur le même principe que la loupe binoculaire mais profondeur de champ plus faible.
• Grossissements plus importants que sur la loupe binoculaire (certains vont jusqu’à x 1 000).

Historique :

• Antiquité : utilisation de globes de verre remplis d’eau pour grossir les objets et concentrer sur eux la lumière.
• XIIIème siècle ; Elaboration de lentilles.
• 1590 : Hans et Zacharias Janssen (père et fils : opticiens hollandais) : 1er microscope ?
• 1609 ? Galilée (savant italien) : ochiolino : 1er microscope ?
• Fin du XVIème siècle : Antoni Van Leeuwenhoek : microscopes artisanaux simples d’usage et de taille réduite → intérêt des biologistes.
• Fin du XVIIème siècle : Christiaan Huygens (savant hollandais) : oculaire de Huygens qui corrige les aberrations chromatiques (amélioration de la couleur et de la netteté).

1. Types de microscopes photoniques.

1. Microscopie photonique simple.

• Même principe que loupe binoculaire.
• Grossissement plus important et moins de profondeur de champ.

• Eclairage essentiellement diascopique (sauf cas particulier).
• Objets observés par transparence → intérêt d’avoir des échantillons de petites tailles (épaisseur de l’ordre de quelques microns).

• Echantillons observés vivants ou morts.
• Echantillons observés colorés ou non.
• La manipulation des éléments regroupés suivants :

Permet l’observation

Permet de rendre l’image nette

Permet de rendre l’image plus ou moins lumineuse.

• L’ajout d’huile à immersion entre l’objet et l’objectif permet d’atteindre un grossissement 1 000.

1. Microscopie à fluorescence.

• Microscope photonique à fluorescence = épifluorescence.

• Certains objets microscopiques sont fluorescents, c’est-à-dire qu’ils émettent sur une longueur d’onde pus courte (lambda = 200 à 300nm).
• Nécessite d’avoir un éclairage spécifique (avec de fortes quantité de bleu et de violet).

• Exemple : éclairage par un « brûleur » au Xénon ou brûleur HBO à vapeur de mercure.

• Eclairage épiscopique
• Lentille en quartz
• Grossissement x 200

• Quels types d’échantillons ?

• Composés naturellement fluorescents chlorophylle ou polymères.
• Ajout de marqueurs fluorescents (fluorochrome).
• Etc.

1. Microscopie photonique à contraste de phase.

• Microscopie photonique à contraste de phase = microscope à interférence différentielle : largement utilisée pour l’observation de cellules vivantes.
• But : amplifier les contrastes naturels.
• Certaines régions des cellules apparaissent alors plus claires que d’autres → contrastes plus importants artificiellement
• Bon pour l’observation d’organismes avec flagelles et cils.

1. Microscopie photonique à fond noir.

• Microscopie à fond noir.
• Observation de cellules vivantes grâce à une augmentation des contrastes naturels.
• Sont équipés d’une condenseur opaque qui ne laisse passer la lumière que de façon oblique sur l’objet.
• Seuls les rayons réfléchis par l’objet seront captés par l’objectif.
• Permet d’observer des objets dont la dimension est à la limite extrême du pouvoir séparateur et qui passeraient inaperçus avec des techniques ordinaires.
• On visualisera les éléments brillants sur fond noir.
• Problème : faible intensité lumineuse pour l’observateur.

1. Préparation du matériel pour la microscopie photonique.

1. Matériel vivant

• Préparation d’un matériel vivant différente d’une préparation d’une coupe histologique (protocole d’observation d’une matériel vivant plus simple).

Matériel vivant : Cellules isolées comme des frotis frais, des spermatozoïdes, du sang, des tissus végétaux, etc.

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