Rappel de procédé utiliser dans be bio dev

Knock-out

Cette technique vise à remplacer un allèle sauvage dans un génome par un allèle tronqué non fonctionnel, de manière à invalider un gène et à en observer les effets.

1. On construit in vitro, un allèle modifié du gène d’intérêt dans lequel on supprime un partie ou toute la séquence codante (allèle KO). Cet allèle est cloné dans un vecteur d’ADN particulier
2. On introduit cette construction dans des cellules ES (cellules souches embryonnaires) de souris en culture. On sélectionne les cellules dans lesquelles l’allèle KO a remplacé l’allèle sauvage grâce au mécanisme de recombinaison homologue. Un gène de sélection inclus dans la construction permet de sélectionner les cellules recombinantes qui vont proliférer en culture alors que les cellules non-recombinantes vont être éliminées.
3. On implante ces cellules dans un blastocyste de souris sauvage. Les cellules ES modifiées vont contribuer aux différents organes et en particulier à la lignée germinale de cette souris chimère. Ainsi cette chimère produirait des gamètes contenant l’allèle KO et des gamètes sauvages.
4. On croise cette souris chimère avec une souris sauvage. Une partie de leurs descendants va donc être de génotype hétérozygote pour l’allèle KO. On dérive par croisement plusieurs individus hétérozygotes (KO/wt). Et enfin on les croise. Ce qui permet d’obtenir des embryons wt/wt, wt/KO ou KO/KO.

HIS

En quelques phrases : ici on parle d’HIS sur ARN et non sur ADN. L’HIS permet de mettre en évidence la position d’ARN d’intérêt dans un tissu/un embryon. Pour cela on synthétise une sonde constituée d’un brin d’ARN complémentaire à l’ARNm ciblé. Cette sonde est marquée par des molécules organiques particulièrement (biotin, digoxigenin, fluorescein). On applique ces sondes sur les coupes ou les embryons entiers perméabilisés et on laisse l’hybridation entre ARNm et sonde se faire. On révèle la sonde avec des anticorps dirigés contre la molécule organique fixée à la sonde, ces anticorps étant eux-mêmes couplés à une enzyme capable de convertir un substrat en produit coloré.

Immunomarquage

Appliquer un anticorps reconnaissant une partie de la protéine dans un tissu.

• Fixer l’embryon avec un fixateur (formol, paraformaldéhyde…)
• Utiliser l’embryon entier (in toto) ou faire des coupes de l’embryon
• Appliquer un anticorps primaire dirigé contre la protéine d’intérêt
• Appliquer un anticorps secondaire reconnaissant le primaire, couplé a une molécule fluorescente ou une enzyme produisant un composé opaque visible a l’œil.

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