Purification du lysosyme du blanc d'oeuf

 BUT

L'objectif du TP est de purifier le lysozyme du blanc d'œuf en utilisant les propriétés ioniques de cette enzyme dans une chromatographie échangeuse d'ions sur colonne. Pour vérifier l'efficacité de la purification, une mesure d'activité enzymatique est ensuite et réalisée et pour finir un dosage colorimétrique par la méthode de Bradford permettrait de quantifier les protéines du blanc d'œuf et d'analyser la purification.

PRINCIPE

Chromatographie d'échange d'ions

Chromatographie échangeuses d'ions est une technique de séparation de molécules, basée sur l'affinité de charge électrique. Elle est composée de deux phases:

• Phase mobile: une solution de tampon aqueux

La molécule d'intérêt va être absorbée sur la résine par liaison ionique. Dans notre cas le lysozyme a un pHi de 11 (qui est  donc supérieur à celui du tampon et au pHi des autres protéines du blanc d’œuf). Cette caractéristique permettra de le purifier.

• Phase stationnaire: phase solide

C'est une résine échangeuse d'ions composé de microbilles sur laquelle sont fixés sois des groupements chargé positivement sois des groupements chargé négativement.

[pic 1][pic 2]

pH

• pH Tampon  >  pHi alors les protéines sont chargées négativement
• pH Tampon <   pHi alors les protéines sont chargés positivement

Or le lysozyme a un pHi = 11 ce qui est supérieur au pH tampon = 8.2 il est donc chargé positivement. Ce qui le différencient des principales protéines contenues dans le blanc d’œuf car elles possèdent toutes un pHi inférieur au pH tampon donc elles sont chargées négativement.

D'où le choix de la résine CM-Cellulose chargé négativement. Donc les autres protéines chargées négativement à pH tampon = 8,2 seront éluées tandis que le lysozyme sera fixé sur la résine par interaction ionique.

La chromatographie :

1. Equilibration: la résine est équilibrée avec un tampon aqueux à un pH donné, ici 8.2 afin de permettre la fixation de la protéine d'intérêt: lysozyme.
2. Fixation ou étape d'adsorption: la protéine d'intérêt (le lysozyme chargé positivement) se fixe à la résine (chargée négativement). Les autres protéines chargées négativement ne se fixent pas sur la résine.
3. Lavage: a pour but d’éliminer les protéines libres et celles fixées non spécifiquement à la résine, ici, la carboxyméthyl cellulose (CM-cellulose).
4. Elution : cette étape se fait par une modification du pH grâce au tampon d'élution avec un pH différent (pH du tampon d’élution = 10,5), mais aussi ce qui entraîne la désorption de la protéine d'intérêt.

NB : une étape de régénération de la résine peut être réalisée permettant de remettre les charges dans leurs valeurs initiales.

Mesure de l'activité enzymatique du lysozyme

Le lysozyme est une enzyme qui hydrolyse liaison β-1,4 entre l'acide N-acétyl muraminique et les résidus de la 2-acétamido-2 désoxy-D-glucose des muco-polysaccharides des parois bactériennes.              

L'activité enzymatique des échantillons est déterminée grâce à la propriété du lysozyme d’hydrolyser les parois des cellules bactériennes.

Le substrat est une suspension de membranes cellulaires Micrococcus Lysodeikticus.   La diminution de la turbidité de la suspension, résultant de l’hydrolyse des membranes, est mesurée au spectrophotomètre à 450 nm. Plus la turbidité du mélange diminue plus l'activité de l'enzyme est forte. Une unité de lysozyme correspond à la quantité d’enzyme qui induit une diminution d’absorption de 0,0001. L’ajout de substrat permettra d’en déduire l’activité enzymatique des différents fractions au cours du temps (car 1 Unité Enzymatique entraîne une diminution de 0,0001d’activité)

Pour déterminer d'efficacité de cette purification des paramètres spécifiques de l'enzyme sont utilisées:
 

• L'activité spécifique : activité enzymatique par mg de protéine

[pic 3]

                                                                                                                       Unité : μmol.min-1.mg-1

L’AS augmente au cours de la purification d’une protéine et atteint une valeur limite lorsque la protéine est totalement pure.

• L'activité enzymatique: quantité de substrat converti en produit par unité de temps au cours d’une réaction enzymatique, dans les conditions optimales de réaction (T°C, pH, concentration saturante en substrat).

• Le rendement permet de déterminer l'aspect quantitatif de la purification 

Rendement

[pic 4]

• Taux de purification est le rapport de l'activité spécifique de l'échantillon permet de déterminer l'aspect qualitatif de la purification. 

[pic 5]

Dosage des protéines

Ce dosage est colorimétrique et se fait par la méthode de Bradford qui consiste à complexer par des interactions non covalentes un colorant, Bleu Coomassie avec des acides aminés basiques (Arg,  His, Lys) et aromatiques (Phe, Tyr, Trp) constituants des protéines. Après l’ajout du réactif de Bradford (10 min), une coloration bleue apparaît, proportionnelle à la quantité de protéine présente. On déterminera ensuite l’absorbance de chaque extrait par spectrophotométrie à 450 nm en comparant à une courbe d’étalon (établie à partir de l’albumine) d’un dosage des protéines

La loi de Beer-Lambert peut être appliquée. Cependant, le coefficient ε étant inconnue, on réalise une gamme étalon à partir d'une solution étalon d'albumine de concentration connu qui nous permettra de déterminer la concentration des protéines du blanc d'œuf contenu dans nos fractions.

RESULTATS

CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS

Préparation des tampons

Tampon d’équilibration :

Pour préparer 250mL de tampon (Tris HCl 0,05M) à partir de solutions mères de NaCl 0,5M pH 8,2, on devra calculer le volume à prélever pour la dilution :

On sait que  donc on peut en déduire Vm :[pic 6]

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