Les techniques générales de génétique moléculaire

                                                                                   Génétique moléculaire

Les techniques générales de génétique moléculaire

1. Extraction/ purification des acides nucléiques

Différents procédés d'extraction ont été mis au point, dépendant, entre autres, de la nature du matériel biologique et du degré de purification que l'on désire obtenir

1. La première étape peut consister en des lavages

1. Il est ensuite nécessaire de lyser (casser) les cellules : le tampon de lyse est constitué de divers composants → détergent, protéase …

1. Des exctractions sont ensuite effectuées, ce qui permet d'éliminer les substances indésirables comme des protéines. Le principe est basé sur la solubilité différentielle des molécules organiques (acides nucléiques/ contaminants) entre deux phases non miscibles :

• la 1ere extraction → phénol
• la 2eme extraction → chloroforme

1. Il faut ensuite faire une précipitation par l'éthanol : cette étape permet de récupérer les acides nucléiques sous forme solide

1. Le dosage des acides nucléiques

Le plus souvent une estimation de la concentration par photométrie est suffisante, les bases puriques et pyrimidiques absorbent fortement les UV à 260 nm.

1. Séparations de l'ADN

1. Ultracentrifugations

1. Electrophorèse :

 Les A.N. sont des macromolécules polyanioniques uniformément chargées. Deux types de tamis moléculaire sont principalement utilisés :

• gels d'agarose : séparation petits fragments, détermination séq ADN
• gels de polyacrylamide : fragments 0,5 à 20 kb ou kpb

 La vitesse de migration d'une molécule d'A.N. sera fonction de deux paramètres :

• sa masse moléculaire (donc le nombre de bases ou de paires de bases)
•  la concentration du gel en agarose ou en acrylamide

1. Fusion et hybridation de l'ADN

Lorsqu'un ADN bicaténaire est chauffé à une température supérieure à la température dite de fusion (Tm), les deux brins de la molécule se séparent par suite de la rupture des liaisons hydrogène (liaisons faibles) qui les maintenaient appariés. Le passage de la forme bicaténaire à la forme simple brin est brutal pour une très faible variation de température autour de la Tm, du fait du caractère coopératif de la réaction.

Les deux brins complémentaires de l'ADN sont maintenus appariés par des liaisons hydrogène (3 entre G et C, 2 entre A et T). La fusion de l'ADN correspond à la rupture de ces liaisons, divers facteurs sont susceptibles d'intervenir dans la stabilité des liaisons et donc de modifier la Tm :

• composition en bases : pourcentage GC
• composition milieu réactionnel
• influence longueur fragments

• Hybridation :

Après une séparation de brins par fusion, aucune réassociation de brins n'est observée si la température est abaissée brutalement, l'ADN va donc rester sous forme simple brin. Par contre, si après la séparation, le refroidissement est lent et, si le tampon est approprié, une réassociation progressive des brins est observée → HYBRIDATION

Peut se faire entre 2 brins ADN, 2 brins ARN ou 1 brin ADN et un autre ARN.

• Sondes :

Fragments d'acides nucléiques simple brin (le plus souvent ADN simple brin) permettant, par hybridation, de repérer et identifier la présence d'une séquence ADN recherchée dans un échantillon biologique.

1. Southern Blot

Le Southern blot est une technique de transfert par capillarité de l'ADN à partir d'un gel d'agarose, sur une membrane en nylon ou en nitrocellulose, créant ainsi sur la membrane une réplique exacte de la migration électrophorétique dans le gel

1. Nothern Blot

Cette technique est équivalente au Southern, mais s’applique à l’ARN. Les ARN sont séparés par électrophorèse sur gel d’agarose dénaturant car il est nécessaire d’abolir les structures secondaires qui gêneraient la migration, l’hybridation et donc l’interprétation de l’autoradiogramme. Southern et northern blots sont toujours utilisés mais leur intérêt est en baisse depuis l’utilisation en routine de la PCR.

1. Hybridation de colonies bactériennes

Cette technique permet de visualiser une séquence complémentaire à la sonde, présente dans une colonie bactérienne

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