Historique et Glossaire du Séquençage

Historique et glossaire du séquençage

L’histoire du séquençage débute en 1977 avec la mise au point des premières techniques de séquençage. Le séquençage désigne une méthode permettant la détermination de l’enchaînement linéaire des nucléotides d’une molécule d'intérêt. A cette époque, deux méthodes émergent grâce au travaux menés par les équipes respectives de Frederick Sanger et d’Allan Maxam et Walter Gilbert.  

1. La méthode de séquençage de Maxam-Gilbert repose sur la dégradation chimique des molécules d’ADN.

On commence par préparer le segment d’ADN à séquencer en le chauffant à 95°C pour séparer les 2 brins : c’est la dénaturation de l’ADN. Il faut ensuite marquer radioactivement les brins d’ADN pour pouvoir les visualiser à la fin de l’expérience. Pour cela on utilise une enzyme, une polynucléotide kinase, qui va venir attacher un phosphate 32 à l’extrémité 5’ de nos fragments d’ADN. Enfin, on sépare les brins dans 4 tubes, où vont se dérouler les réactions chimiques.

On ajoute aux 4 tubes un agent chimique différent, chacun visant à endommager 1 type de base. L’acide formique agit au niveau des bases A et G. Le diméthyle de sulfate agit sur les résidus guanines. Et enfin, l’hydrazine agit au niveau des bases C et T ou seulement sur les C en milieu alcalin. Si on prend l’exemple du diméthyle de sulfate, il produit une réaction de méthylation, en ajoutant un groupement méthyl sur les guanines.

En réaction à ces modifications, la base se décroche, laissant un “trou” dans l'enchaînement nucléotidique appelé site apurinique ou apyrimidique en fonction de la nature de la base supprimée. L’agent chimique est utilisé en petite quantité par rapport à la quantité de matrice car son action ne doit viser qu’un faible pourcentage de bases afin de générer une multitude de fragments de tailles différentes.

On utilise ensuite un autre agent chimique, la pipéridine, pour cliver les séquences d’ADN au niveau des sites apuriniques et apyrimidiques.

On obtient alors des fragments d’ADN de toute taille que l’on va analyser par électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Les fragments d’ADN, chargés négativement par la présence de phosphates, vont migrer en fonction de leur taille vers le pôle positif grâce à l’application d’un courant électrique. Les fragments les plus petits, possédant un poids moléculaire plus faible, migreront plus vite et donc plus loin. La lecture du gel se fait donc du bas vers le haut du gel.

Après migration, on réalise une autoradiographie pour visualiser les fragments. Lorsque l’on observe une bande à la fois sur la piste A-G et sur la piste G, alors il s’agit d’un G, lorsque la bande n’apparaît que sur piste A-G, alors il s’agit d’un A. De la même manière, pour les nucléotides T et C: si une bande apparaît à la fois sur la piste C-T et C, alors il s’agit d’un C, et si la bande n'apparaît que sur la piste C-T, alors il s’agit d’un T.

En lisant le gel de bas en haut on obtient alors l'enchaînement de nucléotides, la séquence d’ADN.

Même si cette technique constitue une avancée prodigieuse pour le monde de la génétique moléculaire à cette époque, elle ne sera pas retenue puisque parallèlement, l’équipe britannique de Frederick Sanger a, elle aussi, développé une technique de séquençage révolutionnaire, jugée plus sûre par l’absence de traitement chimique.

1. La méthode Sanger est un séquençage par synthèse enzymatique, reposant sur l’activité de l’ADN polymérase.

Le séquençage par synthèse enzymatique désigne la synthèse d’un brin d’ADN complémentaire en 5’-3’, à partir d’un brin matrice et de nucléotides, par une ADN polymérase.

La première étape consiste à dénaturer l’échantillon d’ADN par chauffage, puis séparer les simples brins dans 4 tubes.

Le fragment d’ADN cible a été préalablement cloné dans un plasmide afin de l’amplifier pour l’expérience. La séquence du plasmide étant connue, on va pouvoir créer des amorces, aussi appelées primer, qui pourront s’hybrider au niveau de la jonction du plasmide avec notre fragment d’ADN d’intérêt. Ces amorces d’ADN sont nécessaires pour le recrutement et l'accrochage de l’ADN polymérase.

On utilise également des désoxyribonucléotides, notés dNTP et l’un des quatre didésoxyribonucléotides marqués radioactivement, notés ddNTP. Les ddNTP ne possèdent pas de groupement hydroxyle en 3’ rendant impossible la liaison phosphodiester avec le phosphate 5’ du nucléotide suivant.

Les 4 tubes contiennent donc un milieu réactionnel composé de nombreuses copies de la séquence d’ADN d’intérêt, de couples d’amorces, d’ADN polymérases, des dNTP, ainsi que l’un des quatre ddNTP radiomarqué en faible concentration pour permettre leur incorporation aléatoire à toute position de la séquence.

Dès lors qu’un ddNTP va être intégré pendant la synthèse enzymatique, l’élongation s’arrête.

Par la présence de nombreuses matrices ADN, on obtient une incorporation aléatoire des ddNTP radiomarqués à diverses positions et ainsi, de nombreux fragments de taille différente.

On peut alors faire une électrophorèse et une autoradiographie puis lire la séquence du bas du gel vers le haut du gel, comme nous l’avons vu précédemment.

1. La méthode de Sanger est toujours utilisée aujourd’hui mais a été bien améliorée.

On a remplacé le radiomarquage par des fluorochromes, moins dangereux à manipuler que la radioactivité, permettant de regrouper les 4 réactions une seule.

Le développement de la technique de PCR va également constituer un bond extraordinaire pour l’amplification des fragments d’ADN. L’amélioration des techniques de séquençage ont très vite soulevé l’idée d’un projet de grande ampleur, le projet du séquençage du génome humain.

HUMAN GENOME PROJECT

En 1984, l’idée de séquencer le génome humain a été pensée suite aux bombardements atomiques d’Hiroshima et de Nagasaki en 1945 afin de détecter les mutations des survivants de ces événements.

Le projet a alors pour but d’identifier et de soigner les maladies génétiques ainsi que d’en comprendre les prédispositions génétiques afin de pouvoir améliorer les diagnostics et développer de nouveaux traitements.

Ce projet, d’abord programmé sur une durée de 15 ans, a commencé en 1990 et s’est finalement achevé en 2003, soit 2 ans plus tôt que prévu. Il a été coordonné par le Département américain de l’énergie et le National Institutes of Health avec un budget de 3 milliards de dollars qui aura aussi servi à financer d’autres activités scientifiques en parallèle.

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