Etude structurale et fonctionnelle de protéines recombinantes produites dans Escherichia coli

SEFIANE Thibaud                                                    Faculté des Sciences

L3 BHB Groupe 2.4                                                  Site St Charles                                                                        

Compte rendu du TP Atelier Immunologie S5

« Etude structurale et fonctionnelle de protéines recombinantes produites dans Escherichia coli »

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I. INTRODUCTION

En biologie, il est apparu que pour pouvoir étudier à l’échelle de la cellule les mécanismes impliqué dans les processus pathologiques ou physiologique (la migration cellulaire, le développement, les tumeurs, le fonctionnement de capteur biologique, ..) qu’il faut disposer de méthodes permettant l’étude des protéines impliqué dans ces différents phénomènes. Des Techniques ont été développés afin de pouvoir séparer les protéines, d’un extrait protéiques par exemple : en fonction de leurs poids moléculaires et également  caractériser spécifiquement la présence d’une protéine d’intérêt grâce à des processus que nous allons détailler par la suite.

Dans ce Tp nous nous intéressons à une protéine de la catégorie des colorants biologique : La discosoma Red Fluorescent protein ou Ds Red qui a été cloné à l’origine à partir du corail Discosoma sp. Plus particulièrement nous avons étudié un mutant de la Ds Red , la Ds Red T3.

Grace au système bactérien E. coli ,la protéine Ds Red T3 a été produite en clonant son ADNc dans le vecteur d’expression PQE-31 entre les sites de restriction BamHI et SalI .[pic 2]

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L’objectif de ce Tp est de faire l’analyse de la Ds red T3 et déterminer grâce aux techniques utilisés, c’est-à-dire l’électrophorèse et le western Blot. Mais également de comparer ces deux techniques afin de déterminer leurs différences.

II. Principes des Methodes utilisés

• Pour étudier DsRed T3 nous avons réalisé une électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec coloration au Bleue de coomassie . Cette technique est basée sur la mobilité que présentent les molécules (protéine) porteuse de groupements ionisables, en fonction de leurs charges nettes, dans un champ électrique.

Les protéines étudiées se déplacent sur un support exerçant un tamisage moléculaire : Le gel de polyacrylamide. Il y a deux gel superposé l’un sur l’autre : Le gel supérieur ou gel de concentration qui a une teneur plus faible en acrylamide (dans notre TP 4%) et le gel inferieur ou gel de résolution qui a une teneur en acrylamide plus élevé (dans notre TP 10 %). Le taux d’acrylamide détermine la porosité du gel , ainsi le gel supérieur ayant une teneur plus faible que le gel inferieur , le maillage qu’il constitue est plus lâche et permet le passage des molécules plus facilement que le gel inferieur qui a une teneur en acrylamide plus élevé , le maillage qu’ il constitue est plus serré , ainsi les molécules de plus faibles poids moléculaire vont migrer plus facilement que les molécules de poids moléculaire élevé .

Préalablement à la dénaturation, afin de permettre la migration, la chaine polypeptidique doit être dénaturée grâce à l’action du SDS qui va permettre de rompre les liaisons de faible énergie et donc détruire la structure tridimensionnelle de la protéine. Son action est due à une interaction entre la chaine hydrocarbonée du SDS et les groupements apolaire de la chaine polypeptidique afin de l’entourer d’un « nuage » de charge négative. Cela permet donc de masquer la charge nette des protéines et donc toutes les protéines vont se comporter comme des poly anions en termes de migration.

La dénaturation due au SDS est complété par l’action du DTT qui permet la réduction des ponts disulfures.

La migration peut être suivie par utilisation du bleu de bromophenol et le gel est révélé par coloration au bleu de coomassie . Une fois révélé , en fonction des distance de migration observé et des distance de migration de protéine de référence dont le poids moléculaire est connue , il est possible de déterminer le poids moléculaire de protéine d’intérêt par exemple .

• Dans un  second temps nous avons réalisé un western blot . C’est une méthode de biologie moléculaire qui permet la détection de protéines spécifiques sur une membrane. Pour cela on procède préalablement à une électrophorèse afin de séparer les protéines selon leurs poids moléculaires. Il se déroule en plusieurs étapes :

-Etape de transfert : Les protéines du gel d’électrophorèse après migration sont transférées sur membrane, sur laquelle elles vont adhérer par liaison hydrophobe, par un courant électrique. Les protéines étant chargés négativement à cause du SDS , elles vont migrer de la cathode en contact avec le gel à l’anode en contact avec la membrane de nitrocellulose .

-Etape de saturation : Avant de détecter la présence de protéine d’intérêt grâce à des anticorps spécifique de celles-ci, il faut bloquer tous les sites de fixation potentiels de la membrane afin de limiter au maximum les interactions non spécifique. Pour cela on utilise une protéine, l’albumine sérique de bœuf par exemple.

-Etape de fixation de l’anticorps primaire : On incube la membrane avec un anticorps spécifique de la protéine d’intérêt qui va se fixer a celle-ci et former un complexe anticorps – antigène.

-Etape de revelation : On incube la membrane avec un anticorps secondaire  qui reconnait l’anticorps primaire lié à l’antigène, qui est couplé a une enzyme comme la phosphatase alcaline. L’ajout de son substrat qui est le BCIP / NBT donne un produit insoluble coloré attestant de la présence de la protéine d’intérêt. On parle d’indicateur coloré.

III. Protocoles expérimentaux :

• Préparation des extraits bactériens :

Nous avions à disposition deux cultures bactériennes E.coli contenant les plasmides DsRedT3 , l’une induite pour l’expression des protéines et l’autre non induite.

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