Détermination de la composition d'un diholoside par CPG

Détermination de la composition d’un diholoside par Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

1. But

Le but de ce TP est de déterminer les oses composant un diholoside. Pour ce faire, nous allons tout d’abord hydrolyser le diholoside. Les oses obtenus seront réduits puis acétylés en acétate d’alditols afin de pouvoir être analysés en CPG.

1. Principes

1. Hydrolyse du diholoside

Réaction chimique stable durant laquelle une liaison osidique est rompue dans un milieu acide et à haute température. Nous obtenons dans notre cas après hydrolyse 2 oses.

1. Réduction des oses

Il s’agit d’une réaction d’hydrogénation catalytique. En effet, en présence de NaBH4, la fonction aldéhyde CHO est réduite en CH2OH. On obtient alors un alditol pour les aldoses et 2 alditols épimères pour les cétoses

1. Acétylation

L’acétylation est une modification chimique consistant à ajouter une groupement acétyl sur chaque hydroxyle de la molécule d’alditols en présence de pyrimidine (fonction catalytique) et d’anhydride acétique (confère le groupement acétique). On obtient donc des acétates d’alditols, dérivés de composés volatils. De par leur propriété volatile, nous pouvons les analyser en CPG après solubilisation.

1. La Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG)

La CPG est une méthode séparative. En effet, elle repose sur la migration et la répartition différentielle selon l’affinité des molécules avec une phase stationnaire (polymère liquide à haute température) et une phase mobile (gaz). C’est donc une chromatographie de partage.

Le mélange à séparer est injecté à l’aide d’un injecteur en mode split permettant d’injecter l’échantillon rapidement à haute température et empêche la saturation de la colonne. Une fois vaporisés, les composés sont entraînés par un gaz vecteur à travers une colonne capillaire. Selon leur affinité avec les 2 phases, les composés sont séparés puis détectés en sortie de colonne grâce à un détecteur à ionisation de flamme qui, grâce à une flamme à hydrogène, porte l’éluat à haute température. En présence d’oxygène, les composés organiques sont combustionnés et on détecte les ions et électrons libérés.

1. Résultats et interprétations

Pour pouvoir identifier les oses du diholoside, on injecte un mélange témoin d’acétate d’alditols de composition connue. Nous pourrons donc identifier les temps de rétention respectifs à l’acétate de mannitol, de galactitol et de glucitol et ainsi les identifier dans l’échantillon d’acétates d’alditols obtenus à partir du diholoside inconnu.

• Interprétation du chromatogramme témoin

Le chloroforme étant très volatil a le plus petit temps de rétention : Tr = 0,52min

L’acétate de mannitol : Tr = 9,16min

L’acétate de galactitol : Tr = 10,08min

L’acétate de glucitol : Tr = 11,22min

L’acétate d’inositol : Tr = 12,35min

• Inteprétation du chromatogramme obtenu à partir de notre échantillon

Le chloroforme : Tr = 0,50min

Acétate de mannitol : Tr = 8,88min

Acétate de galactitol : Tr = 9,73min

Acétate de glucitol : Tr = 10,74min

• Calcul des temps de rétention relatifs (voir tableau en annexe 3)

Exemple de calcul :

                                [pic 1]

                                                    = 1,1 min[pic 2]

• Détermination de la nature du diholoside

Grâce à notre chromatogramme contenant notre mélange d’acétates d’alditols, nous savons qu’il est composé de deux oses différents (2 pics). En analysant les Tr de ces 2 pics, on peut en déduire, par rapport aux Tr relatifs obtenus dans notre mélange témoin, que les 2 oses sont le galactose et le lactose. Le diholoside est donc du lactose soit du Gal β ( 1 -> 4) Glc.

[pic 3][pic 4]

• Quantité injectée d’acétates d’alditols du mélange témoin

Nous avons une concentration du mélange témoin = 5,184 mg/mL et nous avons injecté 0,8 μL.

On a donc une masse du mélange témoin = [pic 5]

Ainsi, nous pouvons déterminer la quantité d’ose dans le mélange témoin :

                [pic 6]

Nous avons utilisé une masse molaire de 180 g/mol car le rendement de dérivation est de 100%.

La quantité d’ose dans le mélange témoin est équivalente à la quantité d’acétate de mannitol injectée. On a donc :

                        n (actétae de mannitol) = n (acétate de glucitol) = n (acétate de galactitol) =

                                                23nmol

• Quantité de diholoside

On a la masse du diholoside :

[pic 7]

                                                                                                               = 50 x 100 x 10-3 

                                                                                                               = 5 mg

Sachant que la masse molaire du diholoside = 348 g/mol, on a la quantité de diholoside :

                                                 [pic 8]

                                                                       = 14, 37μmol = 14370 nmol[pic 9]

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