Correction compte rendu TP Alpha amylase

Correction compte rendu : Purification de l’Alpha-Amylase de soja par gel de filtration

NOTE : 9,5/20

But :

Il manque une information importante concernant le but de ce TP, il s’agit du fait de vouloir connaitre la masse moléculaire de l’alpha amylase, ce qui représente tout de  même LA finalité de ce TP. Il y aurai pu avoir précision du fait que ce TP inclus non pas une, mais deux chromatographie d’exclusion, mais aussi un test enzymatique sur l’Alpha-Amylase.

Principe :

Gel de filtration :

-Il pourrait y avoir précision du fait que la phase stationnaire est solide et que la phase mobile est liquide.  (Paragraphe 1)

-Ce ne sont pas les molécules les plus grosses molécules qui sortiront les dernières, et donc les plus petites molécules en première, mais l’inverse.  Les protéines les plus petites pénètrent dans les pores plus facilement et de ce fait mettent plus de temps à traverser la colonne. Donc les protéines les plus grosses sortiront en premières et les plus petites en dernières. (Paragraphe 2)

-La limite d’exclusion du gel correspond à la masse moléculaire des plus petites molécules incapables de pénétrer par les pores du gel donné, et non au fait que des protéines plus grosses boucheraient les pores. La présence de protéines dont le poids moléculaires excèderais la limite d’exclusion, montrerais une élution impossible car elles auraient toutes le même volume d’élution qui correspondrait au volume mort. (Paragraphe 2)

-La chromatographie sur gel de filtration n’utilise par forcement des volumes de tampon toujours identique comme pourrait le faire penser le compte rendu, de plus ici il ne s’agit surement pas d’un « principe » mais d’un « protocole », et ce n’est pas ce qu’on demande. Au passage, lors de la phase de rééquilibration, il ne faut pas stocker la colonne dans une solution à 20% d’éthanol, mais faire passer de l’eau ultra-pure et de l’éthanol à 20% dans la colonne, puis stocké la colonne à 4°C, une fois le bouchon de protection visé. (Paragraphe 3)

-Les mesures d’absorbance ne sont pas faites à 230, mais à 215 nm. De plus le maximum d’absorbance des noyaux aromatiques n’est pas du tout 230 nm, mais 280 nm. (Paragraphe 5)

 Dosages des protéines par le réactif de Bradford :

-Il pourrait y avoir rajouté le fait que l’absorbance soit  proportionnelle à la quantité de protéine, inclus une proportionnalité ave la concentration de la protéine.

-Il est faux de dire que l’absorbance ne doit jamais être supérieur à 1, il faut expliquer que la méthode de dosage par le réactif de Bradford, utilise des concentration faible, et que de ce fait si la concentration est proportionnelle a l’absorbance, alors cette dernière n’est pas supérieur à 1.

Résultats :

-Il faudrait logiquement parler de l’annexe 1 avant de l’annexe 2, et non l’inverse.

-Il n’y a pas le nom des axes dans l’annexe 2, avec l’Absorbance en fonction  du numéro des tubes. Il manque aussi la numérotation des pics de 1 à 7.

-Evidemment, s’étant trompé sur le principe de la filtration sur gel, l’attribution des pics et de leurs noms est totalement fausse (même si elle est logique).  De ce fait, il faut prendre l’inverse de ce qu’il y a dans le compte rendu (pic 1 :Bleu dextran/pic 2 :Thyroglobuline/pic 3 :Apoferritine/pic :B-Amylase/pic 5 : ADH/pic6 :Albumine/pic 7 :Anhydrase).

...