Conditions d’élution optimales pour la séparation des acides gras d’un mélange contenant 4 acides gras / HPLC

Biochimie Analytique TP1 – HPLC

Manipulation 1

Objectif

Déterminer les conditions d’élution optimales pour la séparation des acides gras d’un mélange contenant 4 acides gras (C10, C12, C14, C18OH) en utilisant une HPLC.

Principe

La chromatographie liquide haute pression permet la séparation des différentes molécules, dans ce cas la séparation des 4 acides gras. Elle est organisée en deux phases, la phase mobile et la phase stationnaire et elle contient deux pompes qui vont mettre la phase mobile sous pression. La phase mobile est liquide, composé d’un solvant qui dans ce cas va être le méthanol avec une faible concentration de l’eau. Les acides gras sont de molécules principalement apolaires. Il faut, alors, un solvant apolaire pour interagir avec eux, en haute proportion avec l’eau, afin de bien séparer les molécules en fonction de leur polarité. La phase stationnaire est une colonne, dans ce cas en phase inverse avec de particules (billes) à base de silice ultrapure greffées avec des C18. Dans une HPLC les billes sont de très faible diamètre et ont donc un pouvoir de séparation des solutés très efficace. Cependant le solvant a du mal à s’écouler du fait de la taille des billes et il faut donc augmenter la pression pour que celle ci s’écoule. La phase mobile va intéragir avec les acides gras et la phase stationnaire va empecher les interactions entre les acides gras et la phase stationnaire par compétition. Plus la phase mobile est apolaire plus sa force éluante est élevée et permettra alors d’éluer les acides gras les plus retenus par la colonne et qui seront donc les plus apolaires. L’identification des acides gras va prendre lieu grâce à leur marquage avec le bromure de perfluorobenzyl qui absorbe l’UV à λ=262 nm. Un spectromètre relié à l’ordinateur va donner des chromatogrammes sur lesquels il y aura des pics d’absorbance.

Afin de déterminer les conditions optimales d’élution nous allons utiliser un gradient allant de 90% à 100% de méthanol. Nous allons réaliser quatre essais et nous allons choisir la méthode avec les résultats à la résolution optimale, obtenus au minimum de temps (moins de 10 minutes).

Résultats

HPLC 1:

Nous faisons une 1ère HPLC avec une élution en gradient linéaire de méthanol de 92% à 100% en 5 min, nous augmentons donc l’apolarité petit à petit.

Sur le chromatogramme obtenu il y a 5 pics, le premier pic correspond aux marqueurs en excès, il sera retrouvé sur chaque chromatogramme et les 4 autres pics correspondent aux 4 acides gras. Le chromatogramme nous indique que la résolution est très bonne car tous les pics sont suffisamment éloignés et distincts mais il faut un peu plus de 7 min pour avoir les 4 pics des 4 acides gras ce qui est assez long.

Pour la prochaine élution nous essayons donc de diminuer le temps d’élution des 4 AG pour éviter d’avoir une manipulation trop longue. Pour cela on augmente l’apolarité de la phase mobile donc on augmente la concentration de méthanol pour avoir une force éluante plus forte.

HPLC 2:

On fait donc une élution isocratique avec 100% de méthanol.

Le chromatogramme obtenu nous indique que la résolution n’est pas assez bonne car les 2 premiers pics sont confondus et donc pas assez bien séparés pour calculer l’aire sous le pic de façon précise. Cela est due au fait que les 2 premiers AG doivent être moins apolaire que la phase mobile choisi.

Il faut donc rediminuer l’apolarité de la phase mobile et la faire remonté petit à petit.

HPLC 3:

Nous faisons une élution en gradient linaire de 94% à 100% en 3 min

Le 3ème chromatogramme indique une bonne résolution, meilleur que celle de l’HPLC2 et un temps d’environ 6 min pour séparer tout les acides gras, donc plus rapide que l’HPLC1.

Nous essayons quand même de diminuer encore un peu le temps d’élution total.

HPLC 4:

Nous faisons une élution en gradient discontinu/ par palier avec d’abord 94% de méthanol pendant 2 min puis 100%.

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