Compte rendu du TP BI102

Purification et dosage de la caséine puis séparation des acides aminés de la caséine.

Ce TP avait pour objectif d'isoler les caséines des autres constituants du lait en utilisant une précipitation isoélectrique, de doser la concentration de caséine par un étalonnage colorimétrique et d'identifier la composition des tripeptides obtenus après hydrolyse du lait grâce a une chromatographie sur couche mince. Nous avons obtenu différents résultats, le dosage par étalonnage nous donne une concentration molaire de caséine de 3,68e-4 mol/L et on en déduit une concentration massique de caséine de 80 mg/L. Avec la chromatographie nous avons testé 2 solutions de tripeptides. MA1 était constituée de Leu, Pro, Ala et MA2 était constitué de Lys, Ala, et Gly.

Nous utiliserons quelques abréviations tels que :

TP = Travaux Pratiques

e = 10^  

a.a = acides aminés

pI = point isoélectrique

Leu = Leucine

Pro = Proline

Ala = Alanine

Lys = Lysine

Gly = Glycine

HCl = Chlorure d’hydrogène

NaOH = Hydroxyde de sodium

Rf = Rapport frontal

Le but de ce TP est de déterminer la quantité de caséine dans 20 mL de lait écrémé, on va hydrolyser le lait, diminuer le pH du lait au niveau du Pi des caséines en incorporant  et en effectuant une centrifugation on va faire précipiter les protéines . Pour déterminer les a.a. composant les tripeptides restant dans l'hydrolysat de caséine on va les faire migrer grâce a une chromatographie sur couche mince en faisant tremper une feuille de cellulose dans un éluant les tâches vont suivre l'éluant en fonction de leurs affinités hydrophile/hydrophobe. Le dosage colorimétrique sera réalisé grâce au réactif de Folin servant a détecter les protéines.

Protocole :

Pour la précipitation isoélectrique le matériel utilisé est le suivant :

-Bécher

-Centrifugeuse

-Éprouvette graduée

-Tube Falcon

-Acide acétique

-Éthanol à 70% et à 95%

Nous avons prit le lait auquel nous lui avons ajouter de l'acide acétique puis nous avons fait une première centrifugation. Après cela nous lui avons ajouté de l'éthanol à 70%, nous l'avons agité quelques minutes puis remis à centrifuger ainsi que jeter le surnageant. Puis nous avons ajouté à l'ensemble de l'éthanol à 95% pour faire une dernière centrifugation et de nouveau jeter le surnageant. Nous avons ensuite récupéré le précipité que nous avons laissé sécher.

Pour déterminer la concentration de caséine nous avons effectué une gamme d'étalonnage avec le matériel suivant :

-Solution de tyrosine à 50 mg/L solubilisé dans HCl à 0,2 mol/L

-Un hydrolysat de caséine solubilisé dans HCl à 0,2 mol/L

-Réactif de Folin dilué 2 fois

-Du NaOH à 0,2 mol/L

-Pipetman P1000

-Des tubes à essais

-Spectrophotomètre et une cuve a spectrophotométrie

Nous avons réalisé une gamme de concentration allant de 0 à 50 mg/L en procédant à une dilution à partir de la solution pure de tyrosine à 50 mg/L.  Après cela nous avons mis la tyrosine dans un tube à essai, ou nous avons ajouté du NaOH pour rendre le milieu alcalin, cela permettra au réactif de Folin de réagir. Nous mettons le réactif, puis nous prenons des mesures d'absorbance avec le spectrophotomètre. Grâce aux valeurs d'absorbance nous avons tracé la courbe d'étalonnage en fonction de la concentration en tyrosine, ce qui nous a permis de déterminer la concentration massique puis molaire de tyrosine.

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