Compte rendu de biologie moléculaire

Introduction:

Par définition, le clonage d’un gène est «Une opération consistant à isoler un gène, l’introduire dans un vecteur et à le reproduire en grand nombre.» [3]  à ne pas confondre avec le clonage d’un organisme qui est une «opération consistant à produire plusieurs organismes génétiquement identiques.» [4] Tout deux ont pour intérêt de produire des molécules trop complexes à synthétiser par voie chimique, ou constituent une alternative plus intéressante en regard d'autres procédés d'obtention de molécules actives. Par exemple, l'hormone de croissance humaine.

La première tentative de clonage sur un mammifère est réalisé en 1996 avec la naissance le 5 juillet 1996 de Dolly.

Comment réalise-t-on un clonage?

Matériels et Méthodes:

Le premier jour, nous avons réalisé une double digestion avec des enzymes de restriction Eco RI et Hind III qui sont «Des enzymes (Endonucléase) 

la ligase est une enzyme qui est capable de lier de façon covalente deux molécules d’ADN en une, des fragments Addn produits dans la première étape, dans l’eau stérile rajouté sert à ajuster le volume pour le tampon de ligation soit à bonne concentration, trois digéré différentes, l’analyse se fait par électrophorèse.

L’électrophorèse permet la visualisation des fragments de restriction. Le but est de faire migré l’ADN sur un gel d’agarose 1% contenant du Bromure d’éthidium pour observer les différents fragments issus de la digestion, c’est un contrôle de digestion. L’ADN va migré du – vers le + ainsi, les fragments plus lourd seront du côté du – et les fragments plus léger seront du côté du +, ce qui explique pourquoi les fragments de petite taille se retrouvent plus loin du puis de dépôt. Expérimentalement, on peut obtenir 13 fragments par coupure d’une moléculaire circulaire.

Il faut maintenant introduire les molécules que nous avons produite pendant la ligation dans les bactéries, c’est-à-dire réalisé une transformation chimique. Nous avons réalisé un choc thermique (du bac de glace à un bain marie à 42°C pendant 2 minutes puis 5 minutes dans le bac de glace puis après ajout du L-Broth, bain marie à 37°C pendant 30min permettant de laisser le temps à la fabrication de la protéine), sur les bactéries, en faisant bien attention à les manipulés dans la glaces pour ne pas les réchauffer, la réussite du clonage dépend du respect de la manipulation.

A la fin du choc thermique, nous avons réaliser 3 boites de pétri contenant le milieu nutritif des bactéries gélifié grâce à de l’agar, de l’ampicilline (pour sélectionner les bactéries qui nous intéresses) et du X-Gal. Les cultures présentes sur les boites seront celles contenant le gène de résistance à l’Ampicilline, d’où l’intérêt d’avoir un gène de résistance.

Le deuxième jour, nous avons commencé par l’extraction du plasmide qui à été amplifié en suivant les indications inscrit sur le kit d’extraction de plasmide. 3 tubes sont ainsi réalisés, le premier tube A1, permet l’élimination de l’ARN pour en récupéré que le plasmide, le deuxième tube correspond à une solution de lyse et le dernier tube, permet la neutralisation. Le surnagent récupéré, contenant de l’ADN ainsi que des déchets tels que des protéines, est lavé avec une solution AQ contenant de l’éthanol, avant de réalisé une élution, ce qui signifie décrocher l’ADN. Entre les deux étapes, une centrifugation a

Résultats:

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bactériennes qui reconnaissent des séquences spécifiques sur l’ADN de 4 à 8 paires de bases, et qui

clivent l’ADN sur les deux brins au niveau de ces

tubes sont effectués avec des doses de ADN lambda sites. Elles coupent l’ADN au niveau des ponts

Phosphodiesters» [5]. L’enzyme de restriction Eco RI qui est d’origine Escherichia coli RY 13, reconnaît et coupe une séquence bien spécifique de l’ADN: G*AATTC [6]. Et l’enzyme de restriction Hind III d’origine Haemophilus inflenzae Rd reconnaît et coupe une séquence bien spécifique de l’ADN: A*AGCTT [7], ainsi que du tampon de digestion qui correspond au enzymes avec du glycérol nous les avons cloné sur un plasmide qui correspond au vecteur de clonage, c’est-à-dire capables de réplication autonome dans une cellule hôte donnée.Les fragments idéaux pour cloner seront ceux qui possèdent les deux enzymes. Le plasmide pBluescript lui aussi est coupé par une double digestion Eco RI et Hind III.

Nous avons ensuite placé nos tubes dans un bain marie à 70°C afin d’inactiver les enzymes de restriction Eco RI et Hind III, pour pouvoir introduire l’ADN recombinant dans la cellule hôte grâce à une ligation, le plasmide digéré en utilisant un tampon de ligation,

vide est nécessaire, car il y a de l’éthanol, qui peut permettre a l’ADN de se lier à la colonne, on va donc devoir éliminer l’éthanol pour pouvoir réaliser l’élution. On va maintenant pouvoir vérifié par digestion par des enzymes de restriction des plasmides qu’on vient de purifié, avant de réalisé une analyse par électrophorèse des fragments issus de la digestion. Cette analyse, permet de vérifié si on as un fragment inséré dans le vecteur et déterminer lequel (ou lesquels) est-ce parmi les 8 différents, possiblement clonables dans le vecteur pBluescript.