Compte-rendu de TP sur la séparation de l’alanine et de l’arginine sur résine échangeuse d’ions

Compte-rendu de TP sur la séparation de l’alanine et de l’arginine sur résine échangeuse d’ions

• But : le but de ce TP est de séparer l’alanine et l’arginine en utilisant une résine échangeuse d’ions. Nous allons séparer ces deux acides aminés en préparant la colonne pour, dans un premier temps, éluer l’alanine et dans un deuxième temps l’arginine. Une fois l’arginine sortie, nous la doserons en utilisant la ninhydrine et la mettrons en évidence par le biais d’une gamme étalon avec de l’α-naphtol et de l’hypobromite de sodium.

• Principes : durant ce TP nous avons utilisé 5 principes :

• Résine échangeuse d’ions :  c’est une méthode de séparations des molécules. Les ions d’une certaine charge contenus dans une solution sont éliminés de cette solutions par adsorption sur l’échangeuse d’ions pour être remplacé par une quantité équivalente d’autres ions de même charge émis par l’échangeur. Les molécules sont séparées en fonction de leur charge nette et sont éluées en fonction du gradient du pH. La résine étant échangeuse de cations, elle retiendra les acides aminés sous forme cationique.

• Réactif à la ninhydrine : c’est une méthode de dosage des molécules. C’est un réactif qui réagit avec les acides aminés primaires, cela donne une coloration violette, sauf pour la proline qui est un acide aminé secondaire ce qui lui donne une coloration jaune.

• Gamme étalon : cette technique repose sur l’utilisation de solution qui contiennent l’espèce chimique à doser dans différentes concentrations. Elle sert donc à déterminer une concentration. Il s’agit d’une droite passant par l’origine. Pour la réaliser, nous utilisons toujours les essais à blanc et d’autres tubes contenant la molécule d’intérêt. Ici nous tracerons la droite avec l’absorbance corrigée à 570 nm en fonction de la concentration en alanine.  

• Dosage spectrophotométrique : c’est une méthode d’analyse qui permet de déterminer l’absorbance d’une substance donc sa capacité à absorber la lumière qui la traverse. Elle est caractérisée par la loi de Beer Lambert : A = ε * c * l. Avec A : absorbance (sans unité), ε : coefficient d’extinction molaire en L*mol-1*cm-1, l : longueur de la cuve en cm et c : concentration de la substance dans la solution en mol/L.

• α-naphtol : c’est une technique de dosage spécifique à l’arginine. Elle s’appelle réaction de Sakaguchi. Quand l’α-naphtol est mélangé à de l’hypobromite de sodium, il donne une couleur rouge/orangée à l’arginine. Cette coloration est dû à la guanidine qui, en présence d’α-naphtol et de soude (NaOH), développe une coloration rouge/orangée.

• Résultats : dans ce TP nous avons utilisé le mélange A.

Équilibre ionique de l’alanine :

[pic 1]

pHi = (2,34 + 9,69)/ 2 = 6,015.

Équilibre ionique de l’arginine :

[pic 2]

pHi = (9,04 + 12,48)/2 = 10,76.

Tableau montrant la forme majoritaire de l’alanine et de l’arginine à différent pH :

pH de la soude : c’est une base forte donc pH = 14 + log c = 14 + log 1 = 14.

(Log 1 car la solution de NaOH est à 1M).

La résine étant échangeuse de cations, elle retiendra les acides aminés sous forme cationique. L’arginine sera retenue car sa forme majoritaire est la forme cationique alors que l’alanine est sous forme zwitterion à pH 4,2. L’alanine ne sera donc pas retenue et sera éluée en première car elle n’a pas d’affinité avec la colonne à pH 4,2. Au pH de la soude, soit 14, l’arginine est sous forme anionique, elle n’aura donc plus d’affinité avec la colonne et sera éluée en deuxième.

Les acides aminés sont donc élués dans l’ordre croissant de leur valeur de pHi.

Le tube 1 représente le tube témoin pour les tubes 2 à 6. Il contient toutes les solutions (eau distillée + ninhydrine) sauf la molécule d’intérêt, l’alanine. Il sert à vérifier que la ninhydrine ne réagisse pas seule.

Le tube 9 représente le tube témoin pour les tubes 7 et 8. Il contient toutes les solutions (ninhydrine + tampon) sauf la molécule d’intérêt, le filtrat contenant l’arginine. Il sert à vérifier que le tampon seul ne réagit pas.

Tableau montrant les valeurs d’absorbances corrigées à 540 nm des tubes 1 à 9 et leur concentration en alanine

À l’aide de ces valeurs, nous pouvons tracer la droite de la gamme étalon. Cf annexe 1 : gamme étalon du dosage de l’alanine par le réactif à la ninhydrine.

Détail calcul des concentrations : Ci*Vi = Cf*Vf 🡨🡪 Cf = (Ci*Vi)/Vf

...