Compte rendu TP Génétique

Compte-rendu TP

Variant DsRed T3

Introduction

Dans les années 60, une révolution biologique est apparue grâce à la découverte de la GFP (protéine fluorescente verte) qui a permis d’étudier les protéines et ainsi mieux les comprendre dans leur environnement naturel : la cellule.

La DsRed est une protéine ayant la propriété d’émettre une fluorescence de couleur rouge. Elle est issue d’un corail nommé Discosoma. Elle est intéressante car on peut fusionner le gène de cette protéine avec le gène d’une protéine que l’on souhaite étudier. La nouvelle protéine sera alors visible au microscope à fluorescence. L’un de ses défauts rédhibitoires est sa lenteur de maturation car l’une des formes intermédiaires possède une fluorescence verte similaire à celle de la protéine fluorescente verte (GFP).
On étudie dans ce TP un variant de cette protéine, la DsRed T3, qui possède des propriétés plus adaptées à l’étude du fonctionnement de la DsRed (exemple : temps de maturation plus rapide).

Il existe aujourd’hui différents variants de la DsRed qui ont été obtenus par génie génétique. Ces mutations ont permis d’obtenir des formes dimériques, monomériques qui permettent à la protéine de moins s’agréger donc d’être plus soluble mais fluoresce moins. Ces mutations ont permis aussi d’augmenter la brillance ou de changer la gamme de longueur d’ondes concernées par les spectres d’excitation et d’émission.

On va analyser la différence entre les transformants portant la DsRed T3 et la DsRed T3 mutée.

Objectif

Nous avons réalisé une mutation dirigée d’un plasmide qui contient le gène de la DsRed T3 pour lui incorporer des mutations.

Matériel méthode

Précautions d’usage :

Le port de la blouse est obligatoire.
On utilise 3 types de micropipettes : la P1000 qui peut prélever de 200 à 1000 μL ; la P200 qui peut prélever de 20 à 200 μL et la P20 qui peut prélever de 2 à 20 μL.
On fait bien attention de régler les volumes à l’aide des molettes. On pipette avec des embouts stériles et à hauteur des yeux. On appuie seulement au premier cran pour prélever le volume voulu.

On prendra soin de ne rien approcher d’inflammable des becs benzène.

En parallèle on prépare les boîtes de pétri LB-agar qui nous serviront en fin de TP pour déposer les cultures bactériennes. Ainsi que le gel d’agarose pour l’électrophorèse qui servira à plusieurs groupes.

Vortex : appareil utilisé pour mélanger des solutions, notamment dans des micro-tubes

Thermocycleur : appareil effectuant la réaction de PCR