Biologie moléculaire Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative

TP de biologie moléculaire

Séparation d’ADN par électrophorèse analytique et préparative

Le but de ce TP est de préparer de l’ADN plasmidique (ADNp) pour établir sa carte de restriction, ainsi que d’isoler et de purifier le fragment wzc cloné dans ce plasmide.

Résultats :

• Extraction du plasmide :

Le contrôle des préparations de plasmide par électrophorèse en gel d’agarose à 1% est visible en annexe 1.

Nos échantillons représentent les trois dernières pistes du gel. Ici, on obtient deux bandes pour la piste 2 en présence de RNase. Pour la piste 3, on obtient tout d’abord un artefact, puis une bande et une grosse tâche, en absence de RNase.

Pour la piste 2, les deux bandes correspondent à l’ADN plasmidique surenroulé et relâché. En effet, la forme relâchée est plus volumineuse et migre donc moins loin, contrairement à la forme surenroulée, compacte.

Dans le cas de la piste 3, la grosse tâche correspond aux ARN partiellement dégradés par la soude.  On observe toujours la bande correspondant à l’ADNp surenroulé, mais la bande de l’ADNp relâché semble avoir en partie disparue. Ceci peut être dû à une erreur de manipulation lors de l’injection.

La RNase est une enzyme dégradant l’ARN qui coupe principalement après une pyrimidine. Ici, elle va servir à dégrader tout les ARN restants.

• Carte de restriction :

L’agarose est un polymère linéaire qui s’assemble en double hélice pour former un gel servant de tamis moléculaire. En effet, il possède des mailles plus ou moins grandes en fonction de la concentration d’agarose et sépare donc les molécules en fonction de leur masse. Quand on a un pourcentage d’agarose de 1%, on a des pores de plus petite taille que dans un gel à 0,8% et donc on verra mieux la distinction des molécules plus petites sur le gel.

Le profil des digestions enzymatiques par électrophorèse en gel d’agarose à 1% est visible en annexe 2.

Marqueurs de poids moléculaire :

Les fragments de 564 et 125pb ne sont pas visibles : soit ils ont étés exclus du gel, soit les bandes n’étaient pas assez intenses pour être détectées.

De plus, les fragments de 5148 et 4973pb co-migrent et sont confondus.

Grâce aux valeurs de tailles et de distances de migration, on peut tracer la courbe log (taille) = f (distance de migration), visible en annexe 3.

Sur cette courbe, on observe une partie linéaire à partir d’une distance de migration de 2,5 cm. Sur cette portion linéaire, on peut calculer le coefficient directeur :

a = (yc-yd) / (xc – xd) = (3,2-3,4) / (3,55-2,6) = -0,21

Pour retrouver une équation de droite de la forme y = ax + b, il suffit de remplacer avec les valeurs d’un point (ici le point c) : b = yc –a*c = 3,2 + 0,21*3,55 = 3,95

L’équation de notre droite est donc y = -0,21x + 3,95

A partir de celle-ci, on peut déterminer les tailles des fragments ayant migré à au moins 2,5cm à partir de leur distance de migration 

AN tube 7: taille = 10-0,21*2,5+3,95 = 2661 pb.

Pour les fragments ayant migré à plus de 2,5cm, il faudra se servir de la taille totale du plasmide : la somme des tailles des fragments obtenus dans un tube équivaudra toujours la taille du plasmide.

Essais :

Le tube 1 représente le plasmide non-digéré, on devrait donc obtenir une bande pour la forme relâchée, et une autre pour la forme surenroulée. Or, on n’en obtient qu’une. La forme relâchée étant plus volumineuse, on en déduit donc que la forme surenroulée, très compacte, a été exclue du gel.

Le tube 7 présente deux bandes, qui représentent deux fragments. Il y a donc deux sites de restriction pour BamH1 et EcoR1, qui nous permettent de calculer la taille du plasmide, car nous pouvons déterminer précisément la taille de ces deux fragments, de 2661 et 2301 pb. Le plasmide fait donc 2661+2301 = 4962pb.

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