Étude de la fixation des ligands sur les macromolécules

Chapitre 1 : Etude  de la fixation des ligands sur les macromolécules

La formation du complexe enzyme-substrat est apparue nécessaire pour expliquer la spécificité de l’activité catalytique et le fonctionnement cinétique des enzymes.

Pendant la catalyse, le complexe est transitoire car l’enzyme libre est régénéré selon le schéma suivant :

E + S 🡪 ES 🡪 E + P

La formation de ce complexe repose sur des interactions spécifiques entre une région délimitée de la molécule protéique et le substrat. Les interactions ES reposent très généralement sur des liaisons non covalentes. Ces phénomènes sont contrôlés par des équilibres réversibles d’associations et dissociation entre l’enzyme et le substrat.

La mise en évidence du complexe et l’étude de la formation sont très souvent difficiles. Durant la catalyse, la résistance transitoire peut être détectée par des techniques de mesure très rapide exploitant une propriété caractéristique du complexe.

On peut étudier l’équilibre d’association/dissociation par dialyse à l’équilibre. Cette technique met à profit la différence de taille entre l’enzyme macromoléculaire et les effecteurs qui sont de petite dimension. La réalisation pratique repose sur l’emploi d’une membrane semi-perméable qui laisse diffuser librement les seules petites molécules.

• Au départ de l’expérience, on a deux compartiments avec d’un coté l’enzyme et de l’autre le substrat.
• Au bout d’un certain temps, il s’établit un équilibre avec formation du complexe ES.
• A l’équilibre thermodynamique, la concentration en substrat libre dans le compartiment 2 est égale à celle dans le compartiment 1.[pic 1]

Par dosage, on suit l’établissement d’un équilibre du substrat dans les deux compartiments. En fait, la plupart des enzymes étant composées de plusieurs protomères, ce qui compte n’est pas la concentration en enzyme mais le nombre de sites récepteurs.

Pour des sites identiques indépendants, on a :

Pour déterminer le nombre de site, on fait varier la concentration en substrat  et on garde constante la concentration en enzyme. [pic 2]

On utilise souvent, pour les expériences d’équilibre, un ligand marqué par un isotope radioactif. Si on connait, la radioactivité spécifique, une simple mesure de la radioactivité dans un échantillon peut renseigner à tout moment sur la concentration en ligand.

La caractérisation du nombre de site de fixation d’un ligand sur une protéine demande en général la détermination expérimentale de la concentration de ligand libre et de ligand lié. Il est en effet nécessaire d’étudier la variation de :

Si il existe plusieurs classes de sites, la saturation que l’on observe est la somme des différentes saturations. Dans ce cas là :

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