Compte rendu variations cardique

Lamouchi Mohamed

Mohamed.lamouchi@etu.univ-amu.fr

L1 SV groupe 4 B

Résumé

Ce Tp a pour but de réaliser le clonage de molécules d'ADN du phage lambda dans le plasmide pBluescript. Pour se faire on a utilisé deux techniques de biologie moléculaire très courante dans le monde de la biologie : la technique d'électrophorèse en gel d'agarose ainsi que la technique du clonage moléculaire. Grace aux photographies obtenues par électrophorèse montrant la migration des molécules et les résultats obtenus dans les boîtes de Pétri les résultats traduisent une bonne réalisation du protocole malgré une boîte sur les trois qui possède des résultats erronés mais nous allons le détailler plus précisément plus tard dans ce compte rendu.

Abréviations

Introduction

Grâce à l’avancé scientifique nous sommes dans la capacité de cloner un organisme mais il est aussi possible de cloner un fragment d'ADN ou un gène. Le clonage moléculaire, qui est une des techniques les plus connues et la plus basique en biologie moléculaire, est basé sur plusieurs techniques de biologie. Le clonage moléculaire peut permettre la production de protéines complexes, d'antibiotiques, d'enzymes, la création d'animaux et de plantes transgéniques. L 'opération consiste alors à introduire un fragment d'ADN (par exemple le gène que l'on souhaite étudier) dans un organisme unicellulaire. Le plus souvent on utilise comme organisme hôte une bactérie (la plus couramment utilisée étant la bactérie E.coli). On tire ainsi profit des capacités de multiplication végétative et de la grande vitesse de prolifération de ces dernières pour reproduire à l'identique un très grand nombre de copies de ce fragment d'ADN. Pour cela, le fragment d'ADN est introduit dans un vecteur ou plasmide. Ce plasmide est une molécule d'ADN circulaire qui permet à la fois d'introduire la séquence d'ADN à étudier dans le microorganisme récepteur mais aussi d'assurer le maintien de ce fragment d'ADN. Cette étape d'insertion d'un fragment d'ADN dans un vecteur repose sur l'utilisation d'outils et de techniques de biologie moléculaire permettant la recombinaison d'ADN, c'est à dire la production d'une molécule d'ADN dite recombinante issue de l'intégration d'une molécule d'ADN dans une autre. Ces étapes s'appuient sur l'utilisation d'outils moléculaires, des protéines, des enzymes qui permettent de couper, copier et coller un fragment d'ADN dans un autre. Elle possède une région qui permet le clonage appelée polylinker ou sites multiples de clonage, et qui présente un système de sélection par résistance aux antibiotiques. Il existe plusieurs types de vecteurs de clonage tels que le plasmide, les phages P1 et lambda, le cosmide. Ces différents vecteurs de clonage se distinguent par leur capacité à accepter un ADN étranger plus ou moins long. Par exemple le plasmide est une molécule d'ADN circulaire double brin de taille réduite d'origine bactérienne qui ne peut coder que jusqu'à 20 kb.

Apres avoir vu le principe de clonage, nous allons voir la réalisation d’un clonage de molécules d'ADN du phage lambda dans le plasmide pBluescript.

Résultats et discussion

Analyse par électrophorèse des fragments obtenus à l’issue des digestions de l’ADN du phage lambda et du plasmide pBluescript avec Eco R1 et Hind III

Dans le plasmide pBluescript chaque enzyme de restriction ne possède qu'un site de restriction qui se situent 689 pb pour Hind III et à 701 pb pour Eco R1. Le fait que chaque enzyme de restriction ne possède qu'un site de restriction permet d'insérer cette molécule dans la partie souhaitée du plasmide. L'utilisation de deux enzymes de restriction différentes permet d'obtenir un clonage orienté dans le plasmide et d'empêcher la re circularisation du plasmide. Après la digestion, nous devrions avoir un fragment de 12 pb et le reste du plasmide de 2 949 pb.

Le phage lambda a un génome de 48510 pb. L'enzyme de restriction Eco R1 possède 5 sites de restriction sur l'ADN du phage lambda à 21 226 pb, 26 104 pb, 31 747 pb, 39 168 pb et 44 972 pb. L'enzyme de restriction Hind III possède 7 site de restriction sur l'ADN du phage lambda à 23 130 pb, 25 157 pb, 27 479 pb, 36 895 pb, 37 459 pb,

37 584 pb et 44 141 pb. Si nous clivons l'ADN de phage lambda aux niveaux de tous ces sites de restriction, nous obtenons des fragments d'ADN clonables mais également des fragments d'ADN non clonables. En effet la ligation du plasmide pBluescript et l'ADN du phage lambda nécessitent les mêmes sites de restriction avec  des extrémités cohésives. Ne peuvent donc être clonés que les fragments qui possèdent une extrémité Eco R1 et une extrémité Hind III. Seuls 8 fragments d'ADN sont clonables. Ces fragments ont des tailles diverses : 1 904 pb, 947 pb, 1 375 pb, 4 268 pb, 5 148 pb, 1 584 pb, 4 973 pb et 831 pb.

[pic 2][pic 3][pic 4]

Figure 1 : photo de la migration des fragments obtenus à l'issue de la digestion de l'ADN

Etalement des bactéries transformées sur des boîtes de Petri contenant du milieu de culture

Nous pouvons sélectionner les bactéries qui possèdent un plasmide qu'il soit recombinant ou non par une méthode de sensibilité aux antibiotiques. Le milieu de culture contient de l'ampicilline, un antibiotique bactéricide capable de détruire les bactéries par inhibition de la synthèse de la paroi bactérienne. Les plasmides contiennent un gène de résistance aux antibiotiques qui code pour l'enzyme bêta-lactamase qui hydrolyse le cycle bêta-lactame de la pénicilline et ses analogues. De ce fait les bactéries qui possèdent un plasmide, recombinant ou non, survivent dans le milieu de culture grâce au gène de résistance aux antibiotiques du plasmide tandis que les bactéries qui ne possèdent pas de plasmides meurent. Dans les boîtes de Pétri, il n'y a donc que des bactéries possédant un plasmide.

...