TP Structure d'un dipeptide

Biochimie expérimentale

Compte-rendu de TP

Structure d’un dipeptide

1. BUT DU TP

Le but de ce TP est de déterminer la structure ainsi que le nom d’un dipeptide inconnu.

Pour ce faire, on détermine :

• sa composition en acides aminés grâce à une hydrolyse acide suivie d’une chromatographie sur couche mince
• le résidu N-ter grâce à la réaction de dansylation, suivie d’une hydrolyse acide puis d’une chromatographie sur couche mince

1. PRINCIPE DU TP

Pour déterminer la composition en acides aminés du dipeptide :

• L’hydrolyse acide du dipeptide

Les peptides sont composés d’acides aminés liés entre eux par des liaisons appelées liaisons peptidiques. Un dipeptide résulte donc de l’association de 2 acides aminés liés par une liaison peptidique.

La liaison peptidique résulte de la condensation de la fonction carboxylique d’un acide aminé et de la fonction amine d’un autre acide aminé (avec départ d’une molécule d’eau).

Pour identifier les acides aminés du dipeptide, il est possible d’hydrolyser (cad de rompre) les liaisons peptidiques par différents moyens notamment par l’hydrolyse acide. L’hydrolyse acide se réalise à chaud et consiste à passer d’une liaison amide à des fonctions carboxylique et amine. On obtient donc les acides aminés libres.

Il convient de préciser que, lors de cette hydrolyse acide, même si elle n’entraîne pas de remaniement de structure, le Tryptophane (Trp) est détruit, la Glutamine (Gln) est transformée en Glutamate (Glu) et l’Asparagine (Asn) est transformée en Aspartate (Asp).  

• La chromatographie sur couche mince (CCM)

La chromatographie sur couche mince est une chromatographie d’adsorption. Il s’agit d’une technique de séparation des molécules basée sur les différences d’interaction des substances à l’égard de deux phases :

• Une phase stationnaire, très polaire (ici, une plaque de gel de silice)
• Une phase mobile nommée éluant, moins polaire que la phase stationnaire (ici, mélange chloroforme-méthanol-ammoniac par exemple)

Les molécules sont séparées en fonction de leur polarité. La polarité est une propriété caractérisant la différence d’électronégativité entre les atomes qui composent une molécule. Mise au contact de la phase stationnaire (plaque), la phase mobile migre par capillarité entraînant avec elle les composés déposés préalablement. + la molécule sera polaire, + elle sera retenue par l’adsorbant polaire. A l’inverse, + la molécule sera apolaire, + elle sera entraînée par le solvant et migrera.

La grandeur caractéristique de la séparation des molécules est la distance de migration des molécules appelée rapport frontal (noté Rf) avec Rf = d/ D et :

d = distance de migration de la tache (de la ligne de dépôt jusqu’au centre de la tache)

D = hauteur du front du solvant

Plus le rapport frontal sera élevé, + la molécule aura migrée et + elle sera apolaire.

Afin d’identifier les acides aminés, il convient de comparer les rapports frontaux obtenus à ceux des acides aminés « témoins ».

• La réaction avec la ninhydrine

Les acides aminés sont révélés cad rendus visibles grâce à l’action de la ninhydrine.

La ninhydrine est un composé aromatique utilisé pour colorer les acides aminés (rôle de révélateur). Le principe de coloration repose sur une réaction de condensation de la fonction amine primaire, à chaud, avec la ninhydrine. Une molécule de couleur violette (appelée pourpre de Ruhemann) est obtenue.

La Proline étant un acide aminé ayant sa fonction amine engagé dans un cycle (fonction amine secondaire), il n’y aura pas de coloration violette mais on obtiendra une coloration

jaune.

Pour déterminer le résidu N-ter du dipeptide :

• La réaction de dansylation d’un dipeptide

L’acide aminé situé à l’extrémité de la chaîne peptidique présente un groupement alpha-amine (résidu N-ter) libre car non engagé dans une liaison peptidique. Il s’agit donc du premier acide aminé.  

Ce groupement alpha-amine libre peut se condenser, en milieu alcalin, avec le chlorure de dansyle (chlorure de 1-diméthylaminonaphtalène-5-sulfonyle) , formant ainsi une liaison relativement stable et donnant un dansylo-peptide.

Cette réaction de dansylation doit être suivie d’une hydrolyse acide du dansylo-peptide.

Après hydrolyse acide de ce composé (pendant 1 heure et à chaud), on obtient 2 acides aminés libres dont un acide aminé N-ter sous forme de dansyloaminoacide (Dns-aa).

Il convient ensuite de procéder à l’extraction du Dns-aa par l’acétate d’éthyle (éther acétique).

Il est ensuite possible de réaliser une chromatographie sur couche mince afin d’identifier, par comparaison des rapports frontaux, le Dns-aa.

Le principe de la CCM a déjà été expliqué précédemment.

• La fluorescence

Dit simplement, le phénomène de fluorescence correspond à un processus dans lequel un atome absorbe de l’énergie, généralement de la lumière à une certaine longueur d’onde, et réémet instantanément (ordre du nanosecondes) de la lumière à une autre longueur d’onde. La molécule fluorescente est dite fluorophore.

Le DNS-aa, issu de la réaction de dansylation, est fortement fluorescent en lumière UV (254 nm), il est donc facilement repérable.

1. RESULTATS et INTERPRETATION

Résultats CCM 1 (composition en acides aminés)

Tableau des rapports frontaux (Rf) :

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