Extraction de caséine

 Étude d'une protéine, la caséine, présente dans le lait de vache : extraction, détermination de la concentration et analyse de sa composition en acides aminés :

Dans le lait de vache, nous avons obtenue une 0,7 gr de caséines, donc Cmassique = 35gr.L soit un rendement de 125%. Notre deuxième expérience nous a permis de faire le lien entre la concentration en tyrosine libre, en tyrosine totale et en caséine. Les résultats obtenus sont :  Cmassique tyrosines libres = 7,0725.10-2 g.L, Cmassique tyrosine totale = 1,7681.10-1 g.L et donc Cmolaire tyrosine totale = 9,7686.10- 4 M.  Cmolaire caséine= 3,25.10-4 M soit Cmassique caséines= 8,1405 gr.L. On a donc un rendement de : R = 90,45%. Enfin, notre dernière expérience, nous a permis de démontrer que la caséine contient, en plus de la tyrosine, les acides aminés suivant : Asn, Leu et Phe Pro, Ala et Gln.

Introduction :

Nous nous sommes basé sur un lait demi écrémé de vache. Le lait est constitué de 3 types de nutriments : les glucides, les lipides et les protéines. On retrouve 2 types de protéines : les protéines solubles comme les lactalbumines, les lactoglobulines et les immunoglobulines. Mais il y a aussi les caséines, qui représentent 80 % des protéines présentes dans le lait. Dans ce TP, on a cherché à vérifier la masse de caséine contenue dans le lait grâce à une précipitation isoélectrique en sachant que le pHi de la caséine est de 4,6.
On a aussi voulu déterminer la concentration en caséine dans une solution en utilisant une gamme étalon. Nous avons utilisé pour cela la loi de Beer-Lambert.  La caséine a une fonction de stockage et de catalyseur, c'est aussi une molécule à la fois hydrophile et hydrophobe. La caséine est, comme toute protéine, constituée d'acides aminés ( plus d'une centaine ). Nous avons essayé d'en déterminer quelques un grâce à une CCM pour comprendre le fait que cette protéine a une dualité hydrophile-hydrophobe.

Matériel et méthodes :

• Isoler les caséines, protéines présentes dans le lait de vache :

Tout d'abord, 20mL de lait ont été pesés. On lui a ensuite ajouté 5mL d'acide acétique à 0,2M. Après avoir attendu environ 5 min que le mélange se repose, la solution a été centrifugée 10minutes dans un tube Falcon (Tube spécifique pour la centrifugeuse) à 10°c à 4000 tours/min. En fait, l'acide acétique est utilisé pour baisser le pH du lait (pH=6.4-6.8) jusqu'à ph=4.6. C'est le Ph pour lequel la molécule est sous la forme Zwitterion, c'est à dit qu'elle est neutre : il y a autant de charges positives que de charges négatives. En fait, la caséine précipite à ce pH, et donc se détache des autres molécules. On peut alors l'extraire : c'est le point isoélectrique. Une fois le surnageant éliminé, on a laissé le mélange se reposer . Le mélange a été nettoyé grâce à de l'éthanol (solvant organique qui permet d'éliminer les impuretés sans dénaturer le composé produit). . Le précipité obtenue est séché dans une étuve puis pesé.

• Détermination de la concentration en caséines dans une solution :
  

Préparation des solutions  :

Nous n'avons pas dosé directement la caséine, nous avons en déduit sa concentration  en dosant la tyrosine libre, car une caséine contient 3 tyrosines. La gamme étalon a été faite avec des tyrosines pures.

6 solutions pour faire la gamme étalon ont été préparées :

3 autres solutions  d'hydrolysat diluées au  ½  de caséine ont été préparées :

Dosage des solutions grâce au réactif de Folin-ciocalteu :

Toutes les solutions ont été divisées par 2. Puis, elles ont été additionnées de 2.5 mL de soude et 0.25 Ml de réactif de Folin (On utilise le réactif de Folin-ciocalteu pour doser les tyrosines libres. L’intensité de la couleur est proportionnelle au taux de composés phénoliques oxydés.). Ces solutions ont été ensuite agitées au vortex. Nous avons ensuite mesuré l'absorbance de toutes les solutions préparées. Le tube témoin de la gamme étalon sert à étalonner le spectrophotomètre à la longueur d'onde 750nm (le tube témoin a alors une absorbance égale à 0). Cette technique d'analyse des entités utilise la propriété d'absorbance et de concentration. En effet, plus une solution est concentrée, plus elle absorbera de longueur d'onde.

• Détermination des acides aminés contenus dans la caséine:

Principe de la chromatographie de partage :

La chromatographie de partage, peut être pratiquée sur couche mince. La couche mince que nous utilisons est en cellulose, un support polaire : c'est la phase stationnaire. Au contraire, l'éluant est apolaire et constitue la phase mobile.  En fait, les molécules hydrophiles sont restées prés du dépôt car elles se sont accrochées à la cellulose, car elles contiennent un des groupes fonctionnels typiques des molécules polaires (La cellulose possède une fonction alcool, elle fait partie des fonctions capables de faire des liaisons hydrogènes : OH, COOH et NH2). Par opposition, les molécules hydrophobes ont migré en haut de la couche mince car elles se sont accrochées au butanol, qui lui « monte » en haut de la couche mince par capillarité. D'autres techniques de chromatographie existent, comme par exemple la chromatographie par échange d'ions. Il y a également une phase stationnaire et une phase mobile, mais la séparation se fait par la la charge des molécules et non par leur polarité.

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