Cours Biochimie: les molécules

I) Introduction

Les biomolécules composent l’ensemble des êtres vivants.

Pour les étudier, il faut les prélever et les traiter.

Les lipides sont hydrophobes, ils sont donc solubles dans des solvants organiques.

Les acides nucléiques ont une structure peu variée, constituée d’un groupement phosphate avec des charges négatives, d’une base et d’un ose. Ils sont donc solubles dans l’eau.

Les protéines sont une famille variée. Elles différent par leurs tailles, leurs formes, leurs charges, leurs fonctions biologiques… On les étudie en milieu aqueux. Il existe beaucoup de techniques et de critères pour étudier et séparer les protéines.

Il faut d’abord séparer les molécules qu’on étudie des autres.

Pour séparer les molécules les unes des autres :

- On peut les solubiliser

- On peut les précipiter

On dit qu’on fractionne les molécules. Fractionner signifie séparer les molécules les unes des autres.

II) Techniques de précipitation

La précipitation a pour but de concentrer les molécules en solution et d’opérer un fractionnement selon les propriétés hydrosolubles des molécules. La précipitation doit rester un processus réversible, c'est-à-dire que les molécules que l’on va rendre insoluble dans un premier temps doivent garder leurs propriétés biologiques pour que lorsqu’on les resolubilise ces molécules aient toujours leurs propriétés biologiques.

Comment peut-on précipiter des molécules ?

On va occasionner une perturbation du milieu, en modifiant une caractéristique de celui-ci.

On peut modifier :

- La force ionique du milieu

- Le pH

- La température

Dans de nombreuses protéines, l’intérieur est isolé du milieu aqueux par regroupement des acides aminés hydrophobes et la surface de la protéine est hydrophile.

Les interactions ioniques prédominent, mais la protéine a aussi des interactions avec des molécules d’eau. De nombreuses molécules d’eau s’associe à la protéine, on dit que la protéine est hydratée.

La précipitation s’obtient en détruisant les interactions avec les molécules d’eau ou avec les ions qu’on trouve dans le solvant. Il existe une valeur du pH pour laquelle la protéine n’a pas de charge, c’est le pHi (autant de charge négatives que de charge positives, pH isoélectrique).

Au pHi les protéines ont peu ou pas d’interactions électrostatiques avec les ions du solvant. La solubilité est minimale au pHi, donc les protéines vont former des amas et précipiter.

On parle de précipitation isoélectrique.

Lorsque le pH est inférieur au pHi, les molécules sont protonées, donc elles vont avoir tendance à se repousser entre elles. Même type de phénomène si le pH est supérieur au pHi, les molécules sont déprotonées, donc elles se répulsent.

1) Précipitation par les sels

On peut faire précipiter les protéines par les sels. Un grand nombre de sels neutres ont été utilisés pour solubiliser ou fractionner les protéines. Lors des premiers fractionnements, le sel qui était utilisé était le chlorure de sodium, NaCl. Il était utilisé comme précipitant, mais également comme solvant.

Actuellement on utilisé d’autres sels, comme Na2SO4, (NH4)2SO4, MgCl2, COCl2.

L’action de ces sels neutres est fonction de leur force ionique. Elle dépend de la concentration en sel et du nombre de charges électriques sur les ions cations et anions fournis par les sels.

On symbolise la force ionique par µ=(1/2)*somme (Ci*zi²).

La plupart des protéines sont solubles en milieu aqueux à une concentration en sel autour de 0,15M. Lorsqu’on augmente la concentration on augmente la solubilité, on appelle le phénomène dissolution par les sels (salting in). Cela s’explique par des modifications de la tendance d’ionisation des chaines latérales des résidus d’acides aminés polaires (-COO- et -NH3+).

Il y a plus d’interactions avec l’eau, donc une augmentation de la solubilité.

Lorsqu’on continue à augmenter la concentration en sel, la solubilité diminue. A force ionique élevée, une protéine peut être presque complétement précipitée. Cet effet s’appelle le relargage (salting out). Cet effet correspond à la dénaturation réversible de la structure tertiaire des protéines.

Lorsqu’on a une forte concentration en sel, le sel va avoir besoin d’eau, il va empêcher aux protéines d’avoir des relations avec l’eau en neutralisant leurs charges de surface.

Donc la concentration d’eau autour des protéines diminue, donc la solubilité diminue, donc il y a précipitation.

La précipitation dépend de la taille des protéines. Les sels sont classés selon leur pouvoir de salting out. On peut modifier la force ionique au fur et à mesure (ajout par pallier), ce qui va permettre de fractionner les différentes molécules d’un homogénat de protéines (précipitation différentielle).

Les protéines ne précipitent pas à la même concentration, on peut don faire précipiter une protéine, alors que d’autres sont toujours en solution. A chaque étape on va pouvoir récupérer un type de protéine dans le culot, et un autre type qui reste en solution.

Des tables existent pour connaitre les quantités de sulfate d’ammonium à ajouter pour passer d’une étape à l’autre.

Cette technique de relargage est couramment utilisée pour séparer des protéines, car on peut les redissoudre sans dénaturation et que leur activité biologique est conservée.

Le sulfate d’ammonium est le sel le plus utilisé car à saturation on est à 100% de sulfate d’ammonium (ce qui veut dire 100g de sulfate d’ammonium pour 100ml d’eau). A 100% de saturation, sa concentration est suffisante pour précipiter la plupart des protéines. De plus sa densité est de 1,235, mais cette densité n’interfère pas avec la précipitation des protéines.

Pour éliminer le sel, on peut réaliser une dialyse. On introduit une membrane de

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