Biochimie Immobilisation de la B-fructosidase

Gournay Maylis

Moges Maëly

Desmet Lisa

TP immobilisation de la ß-fructosidase

La ß-fructosidase est une enzyme qui catalyse l’hydrolyse du saccharose en un mélange équimolaire de glucose et de fructose.

ß-fructosidase → glucose + fructose

Dans ce TP nous cherchons à déterminer l’activité de cette enzyme. Pour ce faire nous suivons la réaction en dosant le glucose apparu après le blocage de la réaction enzymatique.

1/ Manipulations :

1.1 / Détermination de l’activité de la ß-fructosidase libre 

Cette expérience va permettre de doser le glucose apparu après le blocage de la réaction enzymatique dans le cas d’une enzyme libre

Protocole :

Étape 1 : Réaction enzymatique

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Le tampon acétate est ajouté pour un volume total de 2mL[pic 7]

• enzyme diluée 1/50 soit 40µL dans 2mL  (E) →

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• 0,2 mL de (E) dans chaque tubes → agiter

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[pic 11]

• 0,3 mL de tampon phosphate

5 min à 100°C → permet de stopper la réaction enzymatique

Étape 2 : Dosage du glucose

Nous utilisons du kit glucose dont la notice présente ces mélanges :

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Réalisation des absorbances  au spectrophotomètre à 505 nm

Résultats :

1.2 Détermination de l'activité de la Fructosidase immobile[pic 14]

Inclusion dans l’alginate:

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Activité de la ß-fructosidase immobile :

Le tampon acétate est ajouté pour un volume final de 3 mL dans chaque tubes

• 6 tubes avec des billes d’alginate

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[pic 17]

Ajouter les billes dans chaque tubes + 5 min à 40°C

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Prélever 1 mL de phase liquide → dans des tubes à essai + 0,1 mL de tampon phosphate → agiter et 5 min à 100°C

[pic 19]

Réalisation du kit glucose comme avec l’enzyme libre (dans la partie suivante avec les différentes température d’incubation voulues)

Attention : Nous avons réalisé deux éprouvettes pour faire les billes

1.3 / Influence de la température sur l’activité de la ß-fructosidase libre et immobilisé

[pic 20]

Résultats :

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