Compte rendu de microbiologie : La communication microbienne

TP MICROBIOLOGIE

Communication microbienne

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Sommaire

1)        Introduction        3

2)        Matériel et méthode        4

3)        Résultats et discussion        4

1.  Introduction

Dans certaines conditions de croissance, Bacillus subtilis exprime des protéines impliquées dans l’absorption et l’intégration d’ADN extracellulaire.

Cet état de compétence est finement régulé par un quorum-sensing (QS) impliquant la phéromone ComX et le système à deux composants ComP-ComA. L’activation de ComX nécessite l’expression d’un autre gène, ComQ, dont le rôle n’est pas encore déterminé.

En présence de ComX, une ComP histidine-kinase membranaire active la réponse via le régulateur ComA. Une autre voie convergente utilisant une autre phéromone, le competence-stimulating factor (CSF) peptide, modulerait la réponse en inhibant une phosphatase spécifique de ComP-ComA. Ces dernières sembleraient avoir un contrôle sur le niveau de phosphorylation de ComA.

La transduction de la cascade de signalisation aboutit à l’expression du facteur de transcription de compétence ComK et à la synthèse des protéines d’intégration d’ADN extracellulaire. Les gènes de ComQ, ComX, ComP et ComA sont organisés sur le chromosome dans l’ordre indiqué chez des souches dérivées de la 168 de Bacillus subtilis. On observe une organisation de systèmes QS similaire chez d’autres types bactériens : agrBCDE régulant la virulence chez Staphylococcus aureus et comCDE impliqué dans la compétence chez Streptococcus pneumoniae.

Il est à noter qu’il existe un polymorphisme frappant de phéromones associées spécifiquement à leurs récepteurs. Ceci montre la présence de différents phénotypes chez les staphylocoques et les streptocoques.

La comparaison des loci de QS de B.subtilis 168 et B.natto NAF4 apporte une suggestion quant à l’existence d’un polymorphisme aussi étendu chez Bacillus. Le séquençage de la totalité ou d’une partie des loci comQXPA et la comparaison des spécificités de phérotypes chez des bacilles apparentés montre un polymorphisme saisissant au niveau des séquences codant pour ComQ, ComX et les deux-tiers N-terminal de ComP.

Au cours de ce TP, nous étudierons cette spécificité phéromone-récepteur grâce à la mise en culture de souches « testrices » rendues incompétentes (ComQ - ; ComP +) en présence de phéromones venant de souches « productrices » (ComQXPA +).

1. Matériel et méthode

Durant l’expérience, nous avons manipulé deux souches testrices et deux souches productrices :

• Les « testrices » sont les souches BD2876 (his, leu, met srfa-LacZ) exprimant le récepteur à la phéromone de Bacillus subtilis et BD2877 (his, leu, met srfa-LacZ), exprimant celui de Bacillus Natto. Leur incompétence a été construite par un KO de leur gène ComQ en intégrant des gènes d’antibiorésistance qui ont permis de les sélectionner par la suite.
• Les « productrices » sont les souches BD1890 (dont le génotype est l’équivalent de la souche BD2833, soit his, leu, met srfa-LacZ) exprimant la phéromone de Bacillus subtilis et BD2915 (his, leu, met srfa-LacZ) exprimant celle de Bacillus Natto.

Du fait de la mutation de gènes codant pour la synthèse d’histidine, de leucine et de méthionine, les quatre souches sont dites auxotrophes à ces acides aminés.

Pour mettre en évidence cette spécificité phéromone-récepteur, nous avons mis en culture les souches « testrices » en présence des phéromones de souches dites « productrices ».

L’étude, dans un premier temps, de la croissance bactérienne s’est faite par la mesure d’absorbance à 600 nm à différents temps. Les bactéries qui se sont multipliées sont celles qui ont acquis la compétence par transferts horizontaux de gènes avec celles qui leur sont apparentées. La mise en évidence de cette compétence s’est effectuée par une mesure de l’activité Bêta-Galactosidase.

En effet, les souches manipulées intègrent toutes le gène sfra-LacZ, un gène rapporteur que seules les bactéries compétentes peuvent exprimer. Afin d’accéder à l’enzyme, les membranes ont été brisées avec du toluène. L’ONPG était notre substrat, son changement de couleur après catalyse met en évidence la présence de la Bêta-Gal et permet les diverses mesures d’absorbance.

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