Technique électrophorétique

Electrophorèse sur papier : Cellulose, acétate de cellulose ...

Avantage :

• Pureté
• Neutralité
• Epaisseur et porosité contrôlée
• Faible coût
• Rapidité de la séparation pour de nombreux échantillons

Inconvénient :

• Résolution faible
• Diffusion importante

[pic 1]

Interêt clinique pour la détection de :[pic 2]

• Hypoalbuminémie ou hyperalbuminie
• Hyper a globulinémie et hypoalbuminémie
• Augmentation B-globuline

III) Electrophorèse sur gel d’agarose

 La dissolution de l’agarose se fait à chaud puis refroidissement pour ainsi formé le gel.
[pic 3]

L’agarose à une structure en double hélice associées. C’est un réseau réticulé de mailles plus ou moins grandes.

Agarose 1% (p/v): pores 150 nm

Agarose 0,16% (p/v): pores 500 nm

On peut moduler la taille des pores. Le gel va donc avoir un rôle de tamis moléculaire. Le gel est parti prenante de la filtration.

A pH 7, tous les acides nucléiques sont chargés négativement donc vont tous migrer vers le +. On ne peut donc pas les séparer en fonction de leur charge. On va donc le faire en fonction de leur taille !! Le tamis va alors les empêcher plus ou moins d’avancer.[pic 4]

[pic 5]

Le tampon recouvre toute la surface du gel pour ne pas sécher.

[pic 6]
[pic 7]

Les échantillons ne sont pas colorés. On va donc ajouter u bromure d’éthidium qui va venir s’intercaler dans l’ADN et ainsi devenir fluorescent sous la lumière UV.

[pic 8]

Il suffit ensuite de mesurer les distances de migration et ensuite de tracer une courbe de calibration. La résolution du gel d’agarose est suffisant pour analyser des fragment d’ADN mais pas un ADN complet .

[pic 9]

Pour de l’agarose 1%, on peut séparer des ADN compris entre 500 et 10000 pb

Pour de l’agarose 1,5%, on peut séparer des ADN compris entre 200 et 4000 pb

Pour de l’agarose 2%, on peut séparer des ADN compris entre 100 et 2500 pb

On peut aussi utiliser le gel d’agarose pour séparer des grosses protéines. Mais ce n’est pas la meilleure technique.

IV) Le gel de polyacrylamide

L’acrylamide et la bis acrylamide vont pouvoir s’associer et former des liaisons covalentes, jusqu’à former un réseau que l’on nomme gel d’acrylamide. La formation des liaisons covalente forme la réticulation du gel. La structure est un peu plus solide que le gel d’agarose.

[pic 10]

Ce réseau va aussi avoir des pores dont les dimensions pourront être variable.

[pic 11]

On module la taille des pores en modulant la concentration en acrylamide. Il faut tenir compte de la concentration totale en acrylamide, c’est-à-dire :

T= (acrylamide +bis-acrylamide)

T = (a+b) en g pour 100mL

Le pourcentage de bis-acrylamide :

C = b/a+b x100 (%)

Quand C est maintenue constante et que T augmente, la taille des pores diminue.

[pic 12]

La polymérisation dépend de :

• T et C
• [TEMED] et [persulfate] : 1 à 3mM
• pH
• La température : 20 à 25 degrés

V) Electrophorèse native et dénaturante

1) Electrophorèse en condition dénaturante : SDS PAGE

Nécessite l’utilisation d’un détergent : le sodium dodecyl sulfate (SDS)

[pic 13]

Le SDS va venir se fixer à la protéine. L’association du SDS sur la protéine va déstabiliser celle-ci. L’association des charges déstabilise les liaisons de faible énergie qui sont les liaisons ioniques. La protéine sera totalement dénaturée. Mais on aura formé une micelle protéine/détergent qui aura ainsi une charge négative . Toutes les protéines seront donc chargées négativement. La séparation se fera donc en fonction de la masse des macromolécules, d’où le rôle du gel qui à un rôle de tamis moléculaire.

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