Rapport de Biologie : La transformation bactérienne et ses effets sur la bactérie

Rapport de Biologie : La transformation bactérienne et ses effets sur la bactérie

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Introduction

La transformation bactérienne est une manipulation faite en laboratoire qui consiste en la modification de l’ADN d’une bactérie. La transgénèse est un type de transformation, qui implique l’ajout d’un ou de plusieurs gènes provenant d’un autre organisme, dans une cellule d’un organisme receveur. En effet, l’organisme qui accueille le/les nouveau(x) gène(s) est appelé organisme receveur, tandis que l’organisme d’où proviennent les gènes introduits dans la cellule de l’organisme receveur est dit donneur. Le ou les nouveaux gènes introduits dans la cellule receveuse sont appelés transgènes et s’ils sont exprimés par la cellule, peuvent apporter de nouvelles caractéristiques à cette dernière.

Dans ce laboratoire, nous avons étudié la transformation bactérienne de la bactérie Escherichia coli (E. coli). Cette bactérie (l’organisme receveur), sera donc transformée, ce qui veut dire qu’elle recevra les gènes d’un autre organisme, par le biais d’un plasmide recombiné. Le plasmide est une molécule d’ADN circulaire se trouvant principalement dans les cellules bactériennes. Cette molécule d’ADN est différente et indépendante de l’ADN chromosomique, ce qui signifie qu’elle peut se reproduire indépendamment. Donc, le plasmide dit recombiné est tout simplement un plasmide qu’on a modifié pour y ajouter un gène ou des gènes d’intérêts, provenant d’un organisme donneur. Ici, il s’agira de gènes provenant des coraux Acropora millepora et Discosoma sp. L’utilisation de ces gènes est primordial pour l’expérience, car ils intégreront la production d’une chromoprotéine à la cellule, c’est-à-dire, une protéine produisant un pigment, qui rendra la colonie bactérienne colorée. Pour qu’une colonie bactérienne exprime le gène du plasmide recombiné, il faut au préalable, lui avoir intégré ce plasmide, par une manipulation. En laboratoire, les cellules dites “compétentes”, sont celles ayant subi un traitement au CaCl₂ , qui leur assure la capacité à incorporer de l’ADN. Dans cette expérience, les plasmides recombinés contiennent : une origine de réplication (ori), qui permettra à l’ADN plasmidique d’être dupliqué indépendamment de la bactérie, un gène codant pour une chromoprotéine, qui servira à indiquer, par la coloration des colonies, si la transformation à eu lieu, et un gène de résistance à un antibiotique, la kanamycine (Kan), qui permettra de mettre en évidence la sensibilité des bactéries à cet antibiotique. En effet, le gène de résistance à la kanamycine code pour une enzyme qui inactive cet antibiotique. Ainsi, seules les bactéries ayant intégré le plasmide recombiné pourront survivre dans un milieu contenant cet antibiotique. Avec mon camarade, nous avons travaillé avec le plasmide pBO6, qui contient le gène mRFP1 provenant du corail issu de l’océan indien Discosoma sp. , donnant une coloration rouge à ce dernier. Les autres plasmides étudiés par d’autres camarades sont le pBO5, qui contient le gène amilCP codant pour la chromoprotéine provenant du corail Acropora millepora, qui donne une couleur bleue-violette à celui-ci, et le pBO7, qui contient le gène amilGFP, issu du même corail que le gène amilCP, et qui code pour une chromoprotéine apportant une couleur jaune au corail.

Buts de l’expérience

Cette expérience devrait nous amener à comprendre la transformation bactérienne et nous permettre d’observer et d’étudier les conséquences que ce processus a sur les bactéries. Cela nous permettra également de nous familiariser avec un antibiotique et des bactéries résistantes. Ainsi, nous pourrons mieux comprendre les relations de ces derniers dans le domaine de la médecine. Nous nous exposerons aussi à des manipulations nécessitant de la précision, mettant en œuvre notre minutie.

Principe général de la méthode

Avant de commencer les manipulations, sachant que nous serons exposé à des bactéries, nous nous sommes assuré que nos cheveux étaient bien attachés, que nous portions des gants en latex et une blouse ainsi qu’une surblouse. Nous nous sommes préalablement désinfectés les mains.

Ainsi, nous avons pu commencer le laboratoire. Les trois types de plasmides différents ont été répartis parmi nous, élèves. Nous avons reçu le plasmide pBO6.

Nous avons commencé par allumer le réchaud électrique, qui nous sera utile pendant tout le laboratoire, nous permettant de stériliser nos instruments et l’environnement qui l’entoure. A l’aide d’un marqueur, nous avons inscrit sur les boîtes de Pétri, sans les ouvrir, nos noms, la date, notre classe ainsi que le numéro du plasmide utilisé. Il a fallu également inscrire les lettres suivantes sur les boîtes contenant le milieu LB + Kan (bouillon + antibiotique) : A sur l’une et C sur l’autre, ainsi que les lettres B et D sur les deux boîtes restantes, qui contiennent uniquement le milieu LB (bouillon). Sur les deux tubes Eppendorf contenant les bactéries E. coli compétentes, nous avons dû noter sur l’un le signe + et sur l’autre le signe – , ainsi que nos initiales. Une fois les notations terminées, nous avons enfin pu débuter les manipulations.

Nous avons procédé, dans un premier temps, de manière à incorporer le plasmide recombiné dans nos bactéries E. coli. L’enseignante et l’assistante sont venues ajouter une dose de plasmide pBO6 dans notre tube Eppendorf + . Ce plasmide recombiné contient une origine de réplication, un gène codant pour une chromoprotéine mais, également, un gène de résistance à un antibiotique, la kanamycine. C’est pour cette raison que nous avons utilisé cet antibiotique. En effet, puisque le plasmide possède un gène qui code pour une enzyme permettant de résister à la kanamycine, nous pourrons obtenir des bactéries résistantes à cet antibiotique. Nous avons ensuite placé les deux tubes Eppendorf sur la glace pendant 15 minutes, ce qui a permis aux plasmides de se coller contre la membrane des cellules bactériennes. Puis, nous avons déplacé les tubes dans un bain-marie à 42°C pendant 2 minutes, afin de produire un choc thermique pour que les membranes des cellules se fluidifient et que cela permettent aux plasmides de pénétrer dans la cellule. Nous avons ensuite replacé les tubes dans la glace pendant 5 minutes, ce qui a permis aux pores de la membrane cellulaire

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