Microfilament

[pic 1]

Biochimie

 Structure/Fonction des protéines 1

Compte rendu de travaux pratique :

Production et purification de protéines recombinantes dans Escherichia. Coli

Études structurales et fonctionnelles

CHELBEB Nihal

L3 Mathématiques-Biologie

SOMMAIRE :

1. Introduction :

             L’un des fondements de la biologie est la détermination de la fonction d’une protéine par sa structure tridimensionnelle. Par conséquent, comprendre la fonction d’une protéine revient à étudier la conformation de celle-ci. Nous pouvons utiliser la tubuline comme exemple. Cette protéine remplit non seulement plusieurs fonctions cellulaires mais également plusieurs fonctions biochimiques : il s’agit d’une enzyme qui hydrolyse le GTP et ceci grâce à sa structure tridimensionnelle. En effet, c’est une protéine structurale dont la polymérisation aboutit à la formation de tubes creux et rigides. Dans la cellule, elle s’agence en un réseau de microtubules qui se développent à partir du centrosome afin de créer un système de rails le long duquel les protéines, vésicules et organites peuvent être déplacés d’un site à l’autre de la cellule.

              La conformation spatiale d’une protéine résulte de 3 ou 4 niveaux de structures indépendantes :

1. Structure primaire :

            Elle correspond à la séquence en acides aminés dans un ordre déterminé. Sa conformation est liée à la géométrie de la liaison peptidique. C’est donc un agencement linéaire des acides aminés entre eux.

1. Structures Secondaires :

              Ces structures sont dues aux repliements qu’adopte la chaine peptique sous l’effet de multiples liaisons d’hydrogènes qui s’établissent entre les différents groupement –CO et –NH de son squelette.

1. Hélice alpha : C’est une hélice à spires ou enroulement régulier. Le pas de cette hélice est de 0,54 soit 1 Angström ce qui correspond à 3,6 résidus. Certains acides aminés déstabilisent l’hélice alpha du fait de leur structure et empêche donc la formation de l’hélice comme la Proline. En effet, il n’y a pas de Proline dans une hélice.
2. Feuillet bêta : Les liaisons hydrogènes sont perpendiculaire à l'axe de la molécule. Les chaines peptidiques sont disposées soit de façon parallèle soit de façon antiparallèle. Les chaines latérales (celles des radicaux) se placent au-dessus ou en dessous du plan. Cette structure est moins fréquente que l'hélice alpha car elle est moins stable.

1. Structures Tertiaires :

               La conformation générale d'une protéine dans l'espace s'appelle structure tertiaire. Elle correspond à l'agencement des structures secondaires entre elles. Différents types de liaisons peuvent intervenir dans cette structure :  

1. Liaisons fortes ou covalentes (ponts disulfures S-S entre deux cystéines).
2. Liaisons faibles (Hydrogènes, ioniques ou hydrophobes)

Il y a donc rapprochement dans l'espace des acides aminés éloignés dans les structures primaires. La structure tertiaire est à l'origine de la forme globale de la protéine native.  Elle va permettre à la protéine de former dans l'espace des « domaines » indispensables à sa fonction (par exemple le site actif d’une enzyme).

1. Structures Quaternaires :

               Cette structure ne concerne que les protéines constituées de plusieurs chaines peptidiques appelées sous-unités ou protomes, par exemple l’hémoglobine. C’est un agencement tridimensionnel des protomères entres eux.

Dans le cadre de ce TP, nous nous intéresserons à la protéine DsRed. La fluorescence rouge de cette protéine est due à certains acides aminés particuliers et à leur organisation spatiale pour constituer le fluorophore. Il existe maintenant différents variants de la DsRed qui ont été obtenus en modifiant celle-ci par ingénierie génétique tels que la DsRed1 ou DsRedT3. Ces étapes de mutation ont permis d'obtenir des formes dimériques, monomériques, d'augmenter la brillance ou de changer la gamme de longueur d'onde concernées par les spectres d'excitation et d'émission.

Voici la structure du variant monomérique DsRed1 ainsi que l'organisation de son fluorophore :

[pic 2]

1. Objectifs :

            L’objectif de ce TP est de comparer les deux variants de la DsRed : La DsRedT3 et la DsRedM afin d'expliquer leur différence de fluorescence.

1. Principes des méthodes utilisées :                      

1ère partie : extraction et purification des protéines DsRedT3 et DsRedM

Extraction des protéines :

Cette technique va permettre d’isoler toutes les protéines de la bactérie E. Coli

d’autres débris membranaires.

La chromatographie d’affinité :

            En général, La chromatographie est une technique de purification basée sur l’utilisation d’une phase mobile, qui contient le mélange de substances à fractionner, et une phase stationnaire, au travers de laquelle les substances sont séparées.

...