Dipeptide

Compte-rendu de TP1

Mélange utilisé : B

But

Le but de ce TP est de séparer deux acides aminés : l’alanine et l’arginine par

chromatographie échangeuse d’ions et plus précisément ici de cations. Ensuite, il

faut doser l’alanine à partir de la gamme étalon et mettre en évidence l’arginine qui

est bien séparée de l’alanine par des réactions spécifiques, appellé le test de

sakaguchi.

Principe

Chromatographie échangeuse d’ions : utilise la propriété des protéines d’être

chargées. C’est une type de chromatographie qui consiste à l'identification d’ions à

l’aide d'une résine échangeuse d’ions. Cela est constitué par deux phases : la phase

stationnaire qui est une solution contenant des microbilles poreuses qui peut être

chargée négativement (échange de cation) ou positivement (échange d’anion) et la

phase mobile qui est résine échangeuses d’ions (des tampons). En outre, la

technique est réalisé en trois étapes :

1. Fixation : échange d’ions

2. Lavage : élimination par rinçage du contre-ion et des ions non-fixées

3. Élution : récupération de l’ion échangeur

La séparation repose sur l'échange de contre ion porté par la phase stationnaire

avec les ions de même signe en solution dans la phase mobile.

L’affinité d’un échange pour une molécule varie en fonction du tampon dans lequel

est réalisée la chromatographie. En effet, nous avons utilisé la chromatographie

échangeuse de cations pour ce TP, ci-dessous le procédé de la résine échangeuse

de cations.

Réactif ninhydrine : est un composé aromatique utilisé comme révélateur des Acides

Aminés. Tous les Acides Aminés sont colorée en pourpre de Ruhemann ( à 𝞴 = 570

nm) , seule la proline est coloré en jaune (𝞴 = 440 nm). La ninhydrine réagit avec les

amines primaires, produisant cette coloration en pourpre. Comme la proline possède

une amine secondaire, cela se colore en jaune.

Ci-dessous on peut voir le mécanisme de la réaction :

Réaction de Sakaguchi : c’est une réaction chimique qui permet de mettre en

évidence la présence d’arginine dans une solution en milieu alcalin. En présence de

l’𝛼-naphtol et d’hypochlorite de sodium l'arginine donne une coloration rouge-orange,

sinon la solution se colore en jaune.

Dans l’image ci-dessous, on peut voir le mécanisme de la réaction de Sakaguchi.

Résultats

États d’ionisations de l’Alanine (A, Ala) :

États d’ionisations de l’Arginine (R, Arg) :

Calcul des pHi des acides aminés :

L’alanine :

pk1 = 2,34 et pk2 = 9,69

pHi = ½ (pk1 + pk2) = ½ (2,34 + 9,69) = 6,015

L’arginine :

pk1 = 9,69 et pk2 = 12,48

pHi = ½ (9,69 + 12,48) = 10,76

A pH = 4,2 :

- L’alanine(A) existe sous 2 formes en équilibre : 𝐴𝑙𝑎+ 𝑒𝑡 𝐴𝑙𝑎0

On a l’équation d’Henderson-Hasselbalch, on a : pH = pKa + log [𝑏𝑎𝑠𝑒]

[𝑎𝑐𝑖𝑑𝑒]

D'où on peut en déduire les pourcentages de chaque formes :

4,2 = 2,34 + log [𝐴𝑙𝑎0]

[𝐴𝑙𝑎+]

10 , d'où [ ] = [ ] 4,2−2,34 = [𝐴𝑙𝑎0]

[𝐴𝑙𝑎+]

101,86 𝐴𝑙𝑎+ 𝐴𝑙𝑎0

Or, on sait que a pH = 4,2 : [𝐴𝑙𝑎 ] + [ ] = 100% + 𝐴𝑙𝑎0

[𝐴𝑙𝑎 ] + [ ] = 100% + 101,86 𝐴𝑙𝑎+

[𝐴𝑙𝑎 ]*(1 + ) = 100% + 101,86

D'où [𝐴𝑙𝑎 ] = = 1,36 % + 100%

1 + 101,86

et donc [𝐴𝑙𝑎 ] = 100 - 1,36 = 98,64% 0

- L’arginine existe sous 2 formes en équilibre : 𝐴𝑟𝑔 et 2+ 𝐴𝑟𝑔+

On utilise la même méthode de calcul :

4,2 = 2,17 + log [𝐴𝑟𝑔+]

[𝐴𝑟𝑔2+]

10 [ 4,2−2,17[𝐴𝑟𝑔2+] = 𝐴𝑟𝑔+]

10 [ 2,03 [𝐴𝑟𝑔2+] = 𝐴𝑟𝑔+]

et comme on a à pH = 4,2 : [𝐴𝑟𝑔 [ = 100% 2+] + 𝐴𝑟𝑔+]

d'où : 10 = 100% 2,03 [𝐴𝑟𝑔2+] + [𝐴𝑟𝑔2+]

donc : [𝐴𝑟𝑔 ] = 0,92 % et [ = 99,08% 2+ 𝐴𝑟𝑔+]

Au pH de la soude NaOH 1 mol/L :

Comme NaOH est une base forte, on peut déterminer son pH à partir de la formule

suivante : pH = 14 + log(𝑐𝐵)

D'où

...